试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种试剂盒，其包含探针，探针固定在固相基质上或者游离于溶液中，所称探针能够特异性识别表1里的57个基因中的每个基因的至少一部分区域。本发明专利技术还提供试剂盒的用途、一种构建目标区域测序文库的方法、一种测序方法、一种检测目标区域变异的方法、一种检测目标区域变异的装置。利用本发明专利技术的试剂盒和/或本发明专利技术的方法或装置，能够一次性、简单方便且高特异性的获取结直肠癌的相关基因序列，能够准确检测分析这些相关基因序列，使检测分析结果可以辅助用于结直肠癌的用药指导和/或风险预测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学领域，具体的，涉及试剂盒及其用途，更具体的，本专利技术涉及一种试剂盒、试剂盒的用途、一种构建目标区域测序文库的方法、一种测序方法、一种检测目标区域变异的方法和装置。
技术介绍
结直肠癌是男性和女性最常见的肿瘤之一，根据《worldcancerreport2014》记载，结直肠癌占全球癌症发病率的10％以上，是男性第三常见的癌症，女性第二常见的癌症，且在世界范围内死亡率第四位。每年有120万新确诊的结直肠癌病例，同时有超过60万名患者直接或间接死于结直肠癌。超过65％的新发病例位于人类文明发展水平较高或者很高的国家及地区。遗传因素是结直肠癌发病的诱因之一，但大部分的结直肠癌是散发性的(约95％)。在散发性结直肠癌的形成过程中，驱动基因的体细胞突变起了关键的作用。在腺瘤-癌的模型中(BertVogelsteinetal.2013)，KRAS的激活突变使正常肠粘膜发展成为隐窝异常病灶，进而APC的失活突变使病灶发展成为低级别腺瘤；继而端粒酶的激活使病灶发展成为高级别腺瘤，最后随着TP53的失活突变，病灶发展成浸润性癌。在原位癌发生远端转移形成转移性癌的过程中，伴随着更多的突变，如SMAD4的失活突变等。整个过程并非一蹴而就，而是能持续十余年甚至更长时间。肿瘤具有高度的异质性，即使同一部位的肿瘤(如结直肠癌)，治疗效果也因人而异。为了提高临床肿瘤治疗的效果，考虑肿瘤个体的差异性和肿瘤细胞发展进化的特征，进行针对于不同肿瘤患者的个体化治疗势在必行。随着癌症认知领域的发展和科学技术的进步，基因组测序技术逐渐进入到肿瘤临床应用，个体化的肿瘤基因检测已逐渐成熟。复发和转移是癌症患者的主要致死原因，因此对于结直肠癌患者的复发风险预测，将有助于患者的管理并提高生存率。在科研及临床转化领域的现有技术中，对于这类体细胞基因突变的检测方法主要有PCR-Sanger法、PCR-Mass法、ARMS-PCR法和高通量测序法等。这几种方法的样本均来源于癌症患者手术时所切除的病灶组织样本。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决上述问题至少之一或者提供至少一种可选择的商业手段。依据本专利技术的一方面，本专利技术提供一种试剂盒，其包含探针，所述探针固定在固相基质上或者所述探针游离于溶液中，所述探针能够特异性识别表1里的57个基因中的每个基因的至少一部分区域。本专利技术的试剂盒探针能够特异性识别的基因区域组合，是专利技术人经过信息收集、多次筛选和多次试验组合获得的，这些基因区域组合与结直肠癌的发生发展相关。专利技术人收集的信息包括：目前在结直肠癌患者的预后及复发风险预测方面，研究确定了以下几个方面的预后预测因素：①微卫星不稳定(MSI)。引起微卫星不稳定的原因包括MMR基因的失活突变(PMS2/MLH1/MSH2)及MLH1基因的启动子甲基化等。微卫星不稳定的结直肠癌患者有着更好的预后，但是对于5-FU的辅助化疗可能无获益；②KRAS突变状态。KRAS处于EGFR信号通路的下游。KRAS在结直肠癌患者中有约40％的突变率。KRAS突变型结直肠癌患者往往具有更差的预后。对于KRAS突变型结直肠癌患者，西妥昔单抗靶向治疗无获益；③BRAF突变状态，最常见的BRAF突变是V600E，该突变将导致MEK-ERK信号通路的激活。野生型BRAF结直肠癌患者拥有更好的预后，且BRAF突变状态是独立于KRAS的西妥昔单抗治疗预期因子。④CpG岛甲基化表型(CIMP)，在结直肠癌患者中约有30％人群可以观察到CIMP现象。CIMP是否阳性是一个重要的独立预后因素。⑤此外，SCN5A/CASP5/IL18R1等一些其他重要的基因体细胞突变也被发现与预后相关(RajuKucherlapatietal.2013)。结直肠癌患者往往具有较高的体细胞突变频率，以体细胞突变研究为切入点不仅能辅助揭示结直肠癌的疾病进展，而且可以得到靶药疗效预测以及预后复发风险的信息。表1根据本专利技术的实施例，本专利技术的这一方面的试剂盒还可以具有以下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的一个较佳实施例，所述探针能够特异性识别表2中的区域。这些区域包含67个基因的805个外显子，是专利技术人结合COSMIC、NCBI等数据库的记载数据，利用迭代算法对已选入表1中的57个基因的外显子进行分析并确定各外显子的目标区域的序列后专利技术人进一步利用该算法补充了TCGA以及ICGC数据库记载结直肠癌病例突变的内容，添加了10个基因使目标区域能对记载病例进行最大化的覆盖，即表2中的区域。表2本专利技术的试剂盒包含的探针的长度为25～300nt。为获得能够在同一反应体系中同时特异性捕获所说的区域组合，在本专利技术的一个实施例中，探针是通过先获得初始探针集，再筛选所述初始探针集来确定的。获取所述初始探针集包括：确定所述区域的参考序列，从所述基因的参考序列的一端开始，在所述参考序列上依次获取DNA片段直至所述参考序列的另一端，其中，一条DNA片段为一条初始探针，全部所述DNA片段构成所述初始探针集，所述DNA片段之间完全重叠、部分重叠或完全不重叠，所述初始探针集能够覆盖所述基因区域至少一次。所说的区域的参考序列可以从参考基因组上获取，例如从人参考基因组HG19上获得对应的基因区域，所有的HG19上的对应的区域构成所说的区域的参考序列，HG19可以从NCBI数据库下载。根据本专利技术的一个实施例，利用迭代算法设计获取所述初始探针集，包括：确定所述区域在参考基因组上的位置，获取所述基因区域的参考序列，从所述参考序列的第一个核苷酸开始拷贝所述参考序列获取第一条DNA片段，从所述参考序列的第二个核苷酸开始拷贝所述参考序列获取第二条DNA片段，从所述参考序列的第三个核苷酸开始拷贝所述参考序列获取第三条DNA片段，这样依次获取后续DNA片段直至第N条DNA片段的一端超出所述参考序列，其中，一条DNA片段为一条初始探针，全部所述DNA片段构成所述初始探针集，N为所述初始探针集中包含的初始探针的总数，以获得能够全面覆盖目标基因区域的初始探针集，而且为使最终的探针具高特异性，根据本专利技术的一个实施例，进一步对所述筛选初始探针集，包括：将所述DNA片段(初始探针集)与所述参考序列比对，获得每一条DNA片段在参考序列上的比对次数，过滤掉比对次数超过1的DNA片段。为使最终的探针能在同一反应体系中捕获所说的基因区域，和/或使捕获的基因区域在同一反应条件下被一起洗脱下来，进一步对所述初始探针集进行筛选，包括：去除掉GC含量不在35-70％的DNA片段。最终，获得的芯片/探针最终覆盖的区域包含了67个基因的805个外显子，总大小为168Kb。依据本专利技术的另一方面，本专利技术提供一种上述任一试剂盒在获取结直肠癌相关基因序列、和/或在检测结直肠癌相关基因序列中的突变、和/或在辅助指导结直肠癌用药、和/或在辅助预测结直肠癌风险中的用途。利用本专利技术上述一方面或者任一实施例中的试剂盒，能够一次性、简单方便且高特异性的获取结直肠癌的相关基因序列，检测分析这些相关基因序列，检测分析结果可以用于或者辅助用于结直肠癌的风险预测和用药指导。上述对本专利技术一方面的或者任一实施例中的试剂盒的优点和技术特征的描述，同样适用本专利技术这一方面的试剂盒的用途，在此不再赘述。依据本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种试剂盒，其包含探针，所述探针固定在固相基质上或者所述探针游离于溶液中，所述探针能够特异性识别表1里的57个基因中的每个基因的至少一部分区域；任选地，所述探针能够特异性识别表2中的区域；任选地，所述探针的长度为25‑300nt。

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其包含探针，所述探针固定在固相基质上或者所述探针游离于溶液中，所述探针能够特异性识别表1里的57个基因中的每个基因的至少一部分区域；任选地，所述探针能够特异性识别表2中的区域；任选地，所述探针的长度为25-300nt。2.权利要求1的试剂盒，其特征在于，所述探针的获得包括，获得初始探针集以及筛选所述初始探针集。3.权利要求2的试剂盒，其特征在于，所述获得初始探针集包括：确定所述区域的参考序列，从所述区域的参考序列的一端开始，在所述参考序列上依次获取DNA片段直至所述参考序列的另一端，其中，一条DNA片段为一条初始探针，全部所述DNA片段构成所述初始探针集，所述DNA片段之间完全重叠、部分重叠或完全不重叠，所述初始探针集能够覆盖所述区域至少一次。4.权利要求2的试剂盒，其特征在于，所述获取初始探针集包括：确定所述区域在参考基因组上的位置，以确定所述区域的参考序列，从所述参考序列一端的第一个核苷酸开始拷贝所述参考序列获取第一条DNA片段，从所述参考序列一端的第二个核苷酸开始拷贝所述参考序列获取第二条DNA片段，从所述参考序列一端的第三个核苷酸开始拷贝所述参考序列获取第三条DNA片段，如此依次获取DNA片段直至第N条DNA片段的一端超出所述参考序列的另一端，其中，一条DNA片段为一条初始探针，全部所述DNA片段构成所述初始探针集，N为所述初始探针集中包含的初始探针的总数。5.权利要求3或4的试剂盒，其特征在于，所述筛选初始探针集包括：将所述DNA片段与所述参考序列比对，获得每一条DNA片段在参考序列上的比对次数，过滤掉比对次数超过1的DNA片段。6.权利要求5的试剂盒，其特征在于，所述筛选初始探针还包括，去除掉GC含量不在35-70％的DNA片段。7.权利要求1-6任一试剂盒在获取结直肠癌相关基因序列、和/或在检测结直肠癌相关基因序列中的突变、和/或在辅助指导结直肠癌用药、和/或在辅助预测结直肠癌风险中的用途。8.一种构建目标区域测序文库的方法，其特征在于，包括：(a)获取待测样本中的核酸，所述核酸由多个核酸片段组成，所述核酸片段来自断裂的基因组DNA和/或游离的DNA；(b)末端修复所述核酸片段，获得末端修复片段；(c)加碱基A至所述末端修复片段的两端，获得粘性末端片段；(d)连接接头于所述粘性末端片段的两端，获得接头连接片段；(e)对所述接头连接片段进行第一扩增，获得第一扩增产物；(f)利用权利要求1-6任一试剂盒对所述第一扩增产物进行捕获，获得所述目标区域；以及，(g)对所述目标区域进行第二扩增，获得第二扩增产物，所述第二扩增产物构成所述目标区域测序文库；任选地，所述接头末端为T-粘性末端。9.一种测序方法，其特征在于，包括：根据权利要求8的方法构建目标区域测序文库；对所述目标区域测序文库进行测序，获得测序数据，所述测序数据由多个读段组成；任选地，所述测序为双末端测序，所述测序数据由多对读段对组成。10.一种检测目标...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶明芝，陈翀，费凌娜，万谅，杨青，
申请(专利权)人：广州华大基因医学检验所有限公司，深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44