TM9SF4作为生物标记物用于肿瘤相关的外泌体的用途制造技术

本发明专利技术涉及用于确定受试者中肿瘤转化状况或肿瘤的存在的细胞外微泡生物标记物，以及涉及这种生物标记物的用途和涉及使用这种生物标记物的诊断方法。特别地，本发明专利技术的方法和用途包括分离TM9SF4‑阳性细胞外小泡以及检测优先选自由CD9蛋白、miR‑21和RNU6组成的组中的第二生物标记物的表达。

Use of TM9SF4 as a biomarker for tumor associated exocrine

The present invention relates to a tumor or tumor transformation condition for determining the subjects in the presence of extracellular microbubble biomarkers, and involving the use of these biomarkers and involves the use of this biomarker diagnostic method. In particular, the expression method and the use of the invention comprises second biological markers isolated TM9SF4 positive cells and vesicles preferentially detected selected CD9 protein, miR 21 and RNU6 group consisting of the.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
外泌体生物标记物本专利技术涉及用于确定受试者中肿瘤转化(tumortransformation)状况或肿瘤的存在的细胞外微泡(extracellularmicrovesicle)生物标记物，以及涉及这种生物标记物的用途和使用这种生物标记物的诊断方法。
技术介绍
与恶性(或癌性)肿瘤相反，良性肿瘤一般是缺少侵入邻近组织的能力或者缺乏转移的细胞团。另外，良性肿瘤通常具有比恶性肿瘤更慢的生长速率，且肿瘤细胞经常是分化更多的。尽管大部分的良性肿瘤并不会危及生命，但是许多类型的良性肿瘤具有通过称为肿瘤转化的过程变为癌性(恶性)的潜能。未转移的癌症(初始的或复发的)是没有从身体内的初始部位(其开始的地方)扩散至身体的其他地方的癌症。转移的癌症是已经从其开始的身体的部分(初始部位)扩散至身体的其他部分的癌症。往往可以将良性神经纤维瘤的发展与施旺细胞系(Schwanncelllineage)的细胞中的NF1肿瘤抑制基因的突变联系起来1-3。这些肿瘤可以频繁经历进一步的转化，成为恶性末梢神经片瘤(MPNST)1-3。目前不清楚何种细胞类型特别易受MPNST形成(这是导致从神经纤维瘤发展为MPNST的分子改变)的影响，或者何种肿瘤环境中的其他因素可能促进肿瘤形成。另外，在NF1群体中看到频率升高的神经胶质瘤、特别是视神经的纤维性星形细胞瘤和白血病3。MPNST具有非常不良的预后，因为它们对标准的化学或放射疗法没有响应并具有高转移倾向4-7。NF1患者及其家人很清楚这些事实，这是MPNST的发展为何是患有该疾病的患者最担心的并发症的原因8。然而，早期检测往往受限于这样的事实，即MPNST通常在之前已经存在的大神经纤维瘤内发展，使得即使用MRI也难以检测和区分新的生长或进展。相对于MPNST的偶然发生的对应物，这种诊断延迟可能是NF1中的MPNST的不良结果的原因。这构成了识别可以以非侵入方式检测并指示NF1患者中的MPNST起始和进展的分子变更的主要推动力，该识别将在筛查和早期诊断以及监测潜伏期和临床环境中的疾病或治疗结果是有用的。通常认为存在多种神经纤维瘤亚型，它们在其位置和生长模式、它们与NF1的关联以及它们的恶性转化的潜能方面不同。许多临床和基础科学研究员将神经纤维瘤宽泛地分为皮肤或丛状变体1(plexiformvariant)。丛状神经纤维瘤是几乎唯一出现在NF1患者中的神经纤维瘤变体并且被认为是先天的；它们通过它们的特征性丛状生长模式而不同于局部化的神经内神经纤维瘤。丛状神经纤维瘤具有恶性转化为MPNST的最高风险1。与神经纤维瘤转化为MPNST类似，其他良性肿瘤具有转化为它们的恶性对应物的风险。例如，这种情况是：良性前列腺肥大(BPH)转化为前列腺癌、结肠息肉转化为结直肠癌(colorectalcancer)、良性的痣转化为黑色素瘤、非癌性乳房病症转化为乳腺癌(breastcancer)、肺结核转化为肺癌、初期星形细胞瘤转化为胶质母细胞瘤，以及良性卵巢肿瘤转化为卵巢癌。这些癌症中的大部分也能够转移。细胞外小泡(细胞外囊泡，extracellularvesicle)(EV)是由多种细胞类型分泌的一类膜结合细胞器9。EV非限制性地包括(i)外泌体(外含小体，外来体，exosome)：30-100nm直径的内吞来源的膜状小泡，(ii)核外颗粒体(也称为脱落微泡，SMV)：直接从质膜(PM)脱落的大的膜状小泡(50-1000nm直径)和(iii)凋亡体(50-5000nm直径)：由死亡细胞释放。外泌体(exosome)是以微调和功能有关方式由实际上所有的细胞类型产生和释放的天然的细胞外脂质纳米小泡，使得蛋白和mRNA组合物影响母细胞的类型和病症10-14。这些小泡具有固有的稳定性和跨越生物障碍的能力，使得在容易接触的生物流体，如血液中可以发现来自不同组织的外泌体15-17。考虑到它们的生物作用和特性，认为外泌体是细胞和组织动态平衡以及新陈代谢的变更的早期信息标记，并且外泌体是用于识别新型疾病有关的生物标记物以及显示液体活检范例中的已知的组织标记物的有吸引力的来源。这是在，例如癌症的复杂疾病的诊断中使用外泌体靶向测定的主要前提和希望。主要的挑战在于在特定的病症中外泌体相关的标记物(蛋白质和RNA两者)与特定组织的关联18-21，以及可靠的、可承受的、非侵入的外泌体靶向溶液的优化，和在临床研究及实践中可以实际进行的测试的优化。目前对于能够确定肿瘤的存在(良性、恶性和转移的)或肿瘤的转化状况(良性至恶性和未转移的至转移的)的细胞外小泡生物标记物存在需要。具体实施方式由于，例如外泌体的细胞外小泡的微胞球体本质，可以在不裂解小泡的情况下检测存在于这些小泡中的某些生物分子，因为它们位于膜上，而其他的一些仅在裂解小泡之后可以检测，因为它们位于小泡内。我们出乎意料地发现TM9SF4-阳性细胞外小泡(即容纳TM9SF4蛋白质的细胞外小泡)是可用于确定受试者中肿瘤的存在或肿瘤转化状态的用途非常多的工具，特别是如果使用选自表1的列表的生物标记物。生物标记物类型由以下检测CD9蛋白细胞外小泡膜miR-21miRNA整个细胞外小泡RNU6snRNA整个细胞外小泡TM9SF4蛋白(SEQIDNO:1)是属于跨膜-9超家族(Transmembrane-9Superfamily，TM9SF)的近来描述的跨膜蛋白，跨膜-9超家族(TM9SF)是表征为大的亲水性N端结构域(之后是九个跨膜结构域)的限定明确的蛋白家族22。已知该蛋白在黑色素瘤和急性髓性白血病和脊髓发育不良综合征中过表达，后者是由于带有整个TM9SF4基因的染色体20片段(20q11.21)的三倍至十倍增殖23,24。在细菌的吞噬作用中和转移的黑色素瘤细胞的自食表型(同类相食表型，cannibalphenotype)中涉及TM9SF4，这是往往与不良预后有关的现象25,26。在胃癌和结肠癌中已经频繁检测到自食癌细胞27-30。近来已经表明TM9SF4结合至在多种肿瘤中过表达的pH调节质子泵V-ATPase。该相互相用通过随之发生的pH梯度变更将质子泵异常地稳定在其活跃状态，这进而关系到耐药性和结肠癌细胞的侵入31。CD9蛋白(SEQIDNO:2)是跨膜4超家族的成员，跨膜4超家族也称为四跨膜蛋白家族(tetraspaninfamily)。四跨膜蛋白是具有与其他细胞表面蛋白形成多聚络合物的四个跨膜结构域的细胞表面糖蛋白。编码的蛋白在许多细胞过程，包括分化、粘附和信号转导中发挥作用，且该基因的表达在癌细胞运动性和转移的抑制中起重要作用。CD9蛋白发现于外泌体的表面并认为其是用于源自血浆的纳米小泡的定量分析的外泌体持家蛋白(housekeepingprotein)。MiRNA21(SEQIDNO:3)miRNA是一类小的非编码RNA，其成熟产物约22核苷酸长。它们通过诱导翻译抑制或转录物降解负向调节基因表达32。发现miR-21在包括癌症和心血管病的许多病理学病症中上调33。miRNA的多种靶标(实际上是典型的致癌基因)或肿瘤抑制因子的鉴别已经产生被广泛接受的想法，即miRNA在癌症开始、进展和转移中起关键作用34,35。首次将miR-21记录为多种细胞系中的凋亡抑制因子36。RN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于体外确定受试者中肿瘤的存在的方法，这种方法包括a)提供从所述受试者获得的生物样品，b)从所述样品中分离细胞外小泡，其中，分离细胞外小泡的这个步骤包括分离TM9SF4‑阳性细胞外小泡，c)由在步骤b)中分离的所述细胞外小泡确定合适的生物标记物的水平或存在，以及d)比较在步骤c)中确定的所述生物标记物的水平或存在与一个或多个参考值。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.06 EP 14171464.21.一种用于体外确定受试者中肿瘤的存在的方法，这种方法包括a)提供从所述受试者获得的生物样品，b)从所述样品中分离细胞外小泡，其中，分离细胞外小泡的这个步骤包括分离TM9SF4-阳性细胞外小泡，c)由在步骤b)中分离的所述细胞外小泡确定合适的生物标记物的水平或存在，以及d)比较在步骤c)中确定的所述生物标记物的水平或存在与一个或多个参考值。2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过结合至抗-TM9SF4抗体分离所述TM9SF4-阳性细胞外小泡。3.根据权利要求1-2所述的方法，其中，所述细胞外小泡的至少一部分是外泌体。4.根据权利要求1-3所述的方法，其中，所述肿瘤选自由以下各项组成的列表：结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中枢神经系统肿瘤或MPNST。5.根据权利要求1-4所述的方法，其中，步骤c)中的所述生物标记物选自由以下各项组成的列表：CD9蛋白、miR-21或RNU6。6.一种用于体外确定受试者中肿瘤转化状况的方法，这种方法包括：a)提供从所述受试者获得的生物样品，b)从所述样品中分离细胞外小泡，其中，分离细胞外小泡的这个步骤包括分离TM9SF4-阳性细胞外小泡，c)由在步骤b)中分离的所述细胞外小泡确定合适的生物标记物的水平或存在，以及d)比较在步骤c)中确定的所述生物标记物的水平或存在与一个或多个参考值。7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤a)的所述生物样品获得自受良性肿瘤影响的受试者。8.根据权利要求6-7所述的方法，其中，通过结合至抗-TM9SF4抗体分离所述TM9SF...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗朗切斯科·洛祖波内，安东尼奥·基耶西，保罗·瓜齐，纳塔萨·扎罗夫尼，彼得罗·费鲁齐，达维德·佐科，
申请(专利权)人：外索米克斯锡耶纳股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT