一种检测外泌体的方法及体系技术

本发明专利技术公开了一种检测外泌体的方法及体系，所述方法包括如下步骤：A.采集含有外泌体的生物样本，去除细胞，得到外泌体分析液；对外泌体进行大小鉴定、计数；取外泌体，进行蛋白定量；B.用外泌体检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体含量；C.采用外泌体CEA检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体CEA含量，确定外泌体CEA阴性和外泌体CEA阳性的判断标准；D.基于步骤C的检测结果，将上述外泌体分析液中的外泌体区分为外泌体CEA阴性亚群和外泌体CEA阳性亚群；E.建立生物样本的外泌体分布模型。本发明专利技术的外泌体检测体系能够用于肠癌的诊断和病程监测。

【技术实现步骤摘要】
一种检测外泌体的方法及体系
本专利技术属于生物检测领域，具体地说，涉及一种检测外泌体的方法及体系、尤其是一种检测生物样本中外泌体CEA的方法及体系。
技术介绍
《2015年中国肿瘤登记年报》中的数据显示，2015年中国肿瘤发病数为4249,000例，平均每天就有12,000例新诊断的肿瘤患者，而结直肠癌均是男性与女性发病率最高的五大肿瘤之一。世界卫生组织(WHO)指出防治癌症关键是“早发现、早诊断、早治疗”。因此，采用有效的方法实现癌症的早期诊断对于降低癌症整体死亡率、提高患者生存期起重大作用。目前，临床常用的肿瘤标志物癌胚抗原CEA在肠癌病人血清中的灵敏度仅为30％-50％，早期检出率更低，只有约10％-20％，这样的灵敏度及特异性都满足不了临床早诊早治的需求。肠癌包括结肠癌和直肠癌的防治仍存在大量亟待解决的问题，关键是如何更早期发现、及时干预及如何提高检测灵敏度。外泌体是一类大小介于30-150nm的细胞分泌的囊泡，存在于人各种体液中。外泌体在细胞间通讯、信号转导、肿瘤进展等方面发挥作用，特别地，外泌体通过表面丰富的蛋白分子，在介导肿瘤微环境的形成中起重要作用。近年来研究表明，外泌体携带肿瘤遗传信息(DNA、RNA、蛋白质)，是肿瘤标志物的重要来源之一。2015年，美国安德森癌症中心在Nature上发表重要研究成果，报道胰腺癌细胞外泌体中包含有一种GPC1蛋白，这种蛋白有可能可以作为一种标志物用于非侵入性诊断和筛查处于适合手术治疗阶段的早期胰腺癌。外泌体肿瘤蛋白标志物相对于血清标志物检测，主要两个优势：1.诊断准确性提高，灵敏度提高(尤其是在早期诊断中)；2.特异性提高。因此，检测外泌体肿瘤标志物备受人们关注。癌胚抗原CEA是一种肿瘤(结直肠癌、肺癌等)上皮细胞过表达的一种膜糖蛋白，参与肿瘤的发生和进展。血清CEA是一个广谱的肿瘤标志物，临床上常用于结直肠癌、肺癌、胃癌等辅助诊断及病程监控，然而，血清中CEA的检测灵敏度低，不能满足临床要求。至今，结直肠癌临床检测缺乏一种检测灵敏度高、特异性好的方法。相关文献报道，外泌体上存在CEA，但迄今为止，外泌体CEA与结肠癌、直肠癌的关系尚未见报道。
技术实现思路
为了更清晰地分析生物样本比如血清中的外泌体CEA与结直肠癌之间的关系，为探讨外泌体CEA作为结直肠癌诊断指标的可行性、研究生物样本种类与外泌体大小和CEA含量之间的关系、并且为生物样本种类与外泌体CEA之间关系的研究提供实验设计基础，进而探讨外泌体CEA在结直肠癌诊断中的临床意义，本专利技术采用新的定性和定量检测技术并结合数理统计手段来建立生物样本的外泌体分布模型。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种检测外泌体的方法，包括如下步骤：A.采集含有外泌体的生物样本，去除细胞，得到外泌体分析液；对外泌体进行大小鉴定、计数；取一定数量的外泌体，进行蛋白定量。B.用外泌体检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体含量，所述外泌体检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体，CD9和/或CD63和/或CD81标准品，化学发光底物液；C.采用外泌体CEA检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体CEA含量，确定外泌体CEA阴性和外泌体CEA阳性的判断标准，所述外泌体CEA检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗癌胚抗原CEA单克隆抗体，CEA蛋白标准品，所述CEA蛋白可以是CEA重组蛋白，化学发光底物液；D.基于步骤C的检测结果，将上述外泌体分析液中的外泌体区分为表面不包含CEA蛋白的外泌体CEA阴性亚群和表面包含CEA蛋白的外泌体CEA阳性亚群，并且计算外泌体CEA阴性亚群和外泌体CEA阳性亚群的比例；E.基于步骤A至D的检测结果，建立生物样本的外泌体分布模型。上述生物样本选自全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液、或眼泪。优选地，所述生物样本是血清。优选地，当生物样本是血清时，检测血清CEA，并且比较分析检测外泌体CEA与血清CEA的灵敏度及特异性。其中血清CEA的检测可采用常规技术手段进行检测。由于血清CEA已经是一个广谱的肿瘤标志物，并且在临床上用于结直肠癌、肺癌、胃癌等辅助诊断及病程监控，如果血清CEA水平与血清中外泌体CEA水平之间存在特定关系比如线性关系，那么血清中外泌体CEA有潜力成为一种肿瘤标志物从而用于癌症的诊断及病程监控。上述的方法中，步骤B和/或步骤C中的酶可以是常用于ELISA中的酶，选自过氧化物酶比如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、磷酸酯酶或荧光素酶等，比如是碱性磷酸酶。在上述方法的步骤C中，可以将外泌体分析液梯度稀释，分析稀释倍数与相应发光值关系，以便验证检测到的信号是否是CEA特异性信号。此外，在上述方法的步骤C中，可以将CEA重组蛋白加入到CEA阴性生物样本中，验证外泌体CEA检测体系中的抗CEA单克隆抗体是否是仅与游离CEA重组蛋白发生交叉反应、但不与阴性生物样本中其他蛋白发生交叉反应。这种情况下CEA重组蛋白可以作为外泌体CEA替代物或同工蛋白，从而用作外泌体CEA标准品。优选地，在上述方法的步骤B和/或步骤D中，采用磁性微粒捕获外泌体后，采用添加有低浓度吐温(比如0.05％Tween-20)的洗液(或称洗涤液)洗涤磁性微粒，以便去除非特异性捕获物。与上述方法相适应地，本专利技术的另一目的是提供一种用于检测外泌体的试剂盒，其包括外泌体检测体系和外泌体CEA检测体系，其中外泌体检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体或多克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体，CD9和/或CD63和/或CD81标准品，化学发光底物液；外泌体CEA检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体或多克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗癌胚抗原CEA单克隆抗体，CEA蛋白标准品，所述CEA蛋白可以是CEA重组蛋白，化学发光底物液。上述的试剂盒中，外泌体检测体系和外泌体CEA检测体系中用于捕获外泌体的捕获抗体是单克隆抗体或多克隆抗体，更优选都是单克隆抗体，选自下组：抗CD9抗体，抗CD63抗体，抗CD81抗体；抗CD9和CD63抗体，抗CD9和CD81抗体，抗CD63和CD81抗体；抗CD9、CD63和CD81抗体。相对应地，外泌体检测体系中酶标记的抗体是单克隆抗体，选自下组：抗CD9单克隆抗体，抗CD63单克隆抗体，抗CD81单克隆抗体；抗CD9和CD63单克隆抗体，抗CD9和CD81单克隆抗体，抗CD63和CD81单克隆抗体；抗CD9、CD63和CD81单克隆抗体。优选地，当捕获抗体和酶标记的抗体是混合物时，两种以上抗体之间的摩尔比为1：1。本专利技术的试剂盒可用于用于测定含有外泌体的生物样本比如血清中的外泌体CEA。在一种优选的实施方式中，上述试剂盒中的外泌体检测体系和外泌体CEA检测体系还分别包括稀释液和洗液。优选地，所述稀释液比如是含0.1wt％BSA的PBS缓冲液；所述洗液比如为25倍的PBST。本专利技术设计的洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测外泌体的方法，包括如下步骤：A.采集含有外泌体的生物样本，去除细胞，得到外泌体分析液；对外泌体进行大小鉴定、计数；取一定数量的外泌体，进行蛋白定量。B.用外泌体检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体含量，所述外泌体检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体，CD9和/或CD63和/或CD81标准品，化学发光底物液；C.采用外泌体CEA检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体CEA含量，确定外泌体CEA阴性和外泌体CEA阳性的判断标准，所述外泌体CEA检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗癌胚抗原CEA单克隆抗体，CEA蛋白标准品，化学发光底物液；D.基于步骤C的检测结果，将上述外泌体分析液中的外泌体区分为表面不包含CEA蛋白的外泌体CEA阴性亚群和表面包含CEA蛋白的外泌体CEA阳性亚群，并且计算外泌体CEA阴性亚群和外泌体CEA阳性亚群的比例；E.基于步骤A至D的检测结果，建立生物样本的外泌体分布模型。

【技术特征摘要】
1.一种检测外泌体的方法，包括如下步骤：A.采集含有外泌体的生物样本，去除细胞，得到外泌体分析液；对外泌体进行大小鉴定、计数；取一定数量的外泌体，进行蛋白定量。B.用外泌体检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体含量，所述外泌体检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体，CD9和/或CD63和/或CD81标准品，化学发光底物液；C.采用外泌体CEA检测体系，测定上述外泌体分析液中的外泌体CEA含量，确定外泌体CEA阴性和外泌体CEA阳性的判断标准，所述外泌体CEA检测体系包含：偶联有抗外泌体表面标志物CD9和/或CD63和/或CD81单克隆抗体的磁性微粒，酶标记抗癌胚抗原CEA单克隆抗体，CEA蛋白标准品，化学发光底物液；D.基于步骤C的检测结果，将上述外泌体分析液中的外泌体区分为表面不包含CEA蛋白的外泌体CEA阴性亚群和表面包含CEA蛋白的外泌体CEA阳性亚群，并且计算外泌体CEA阴性亚群和外泌体CEA阳性亚群的比例；E.基于步骤A至D的检测结果，建立生物样本的外泌体分布模型。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B和/或步骤C中，所述酶选自辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP、磷酸酯酶或荧光素酶。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤C中，将CEA重组蛋白加入到CEA阴性生物样本中，验证外泌体CE...

【专利技术属性】
技术研发人员：周小进，何林富，王义，
申请(专利权)人：上海良润生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31