一种尿液外泌体miRNA的分析方法技术

本发明专利技术提供一种尿液外泌体miRNA的分析方法，包括尿液标本的收集，外泌体及其总RNA的提取，cDNA文库的建立及Illumina测序，测序结果的处理和注释，获取样本miRNA表达量的表达信息。通过高通量测序技术，对尿液标本外泌体miRNA分析处理，获取miRNA的表达信息；通过建立IgA肾病患者和健康对照者的数据库，利用靶基因功能预测深入研究差异表达的miRNA,深入研究这些差异表达的miRNA将有助于进一步阐明IgA肾病的发病及致病机理，为IgA肾病的诊断提供新的方法及理论基础。该方法设计合理可行，能够有效的建立一种无创的精准的差异表达的miRNA方法，为临床诊治工作提供新的思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学，尤其涉及一种尿液外泌体miRNA的分析方法。
技术介绍
尿液是临床检测中常用的标本，由于可通过无创操作获得并容易大量收集等优点，而成为诊断肾脏疾病的重要标本来源。目前关于尿液中肾脏疾病生物标志物的研究主要集中于蛋白组学及代谢组学方面，然而这些蛋白及代谢产物类生物标志物容易受其它因素干扰，对标本保存的要求高。外泌体曾一度被认为是毫无意义的细胞“尘土”，但随后研究证实它是生物信息的重要载体。外泌体内含有许多生物活性分子包括蛋白（生长因子和细胞因子等）、mRNA和microRNA，为其成为疾病诊断标志物提供了物质基础。研究者们进行外泌体内蛋白分析发现，外泌体内含有许多来源于肾脏的细胞特异性的蛋白，并且进一步研究证实尿液中外泌体非常稳定，具有成为诊断肾脏疾病的生物标志物的潜能。尿液中包含来自于细胞和游离DNA的核酸，这些外源性核酸不能成为标志物的稳定来源，因为它们可能还来自于凋亡细胞，它们的转录组学变化并不能反应功能细胞的病理情况。研究发现，尿液外泌体中含有编码肾单位及集合管的所有蛋白的mRNA，可见尿液外泌体中含有可能反应肾脏功能的核酸，如何获取准确的尿液外泌体中miRNA是本领域技术人员深层次研究的必要课题。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术解决现有分析方法存在操作繁琐、误差较大的问题，提供一种尿液外泌体miRNA的分析方法，为后期临床医学研究提供必要的数据参考。解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种尿液外泌体miRNA的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）尿液标本的收集：收集个体人的晨尿120ml作为尿液标本；（2）外泌体及其总RNA的提取：将收集的尿液标本按以下离心步骤提取外泌体：先依次按400g、2000g和10000g离心力分别离心10min、20min和30min，以去除尿液标本中的细胞及细胞碎片等大颗粒，收集上清液；然后利用超高速离心机以200000g离心力离心之前收集的上清液，时间为1小时，弃上清得胶状沉淀；然后用PBS缓冲液重悬沉淀，再次200000g离心1小时；收集沉淀，加入Trizol试剂，-80℃保存以备RNA提取；提取样本总RNA：常温下解冻样本，加入0.2ml/1mlTrizol氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，4℃12000g离心15min；吸取上层水相，加入0.5ml/1mlTrizol异丙醇，室温放置10min，4℃12000g离心10min；去上清，用1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃7500g离心5min；去沉淀，干燥8min，加入RNA溶解液，-80℃保存备用；利用Agilent2200TapeStation和ND-1000Nanodrop仪器对提取的RNA样品进行浓度及质量检测；（3）cDNA文库的建立及Illumina测序：以1μg起始量，用Illumina公司配套的TruSeqRSmallRNASamplePrepKit进行文库构建：先对RNA进行3’端和5’端连接修饰，然后利用逆转录试剂合成第一链cDNA，利用PCR扩增得到DNA产物，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出小分子DNA，最终获得高通量测序DNA文库，并用Agilent2200TapeStation对文库进行质检；将制备的文库按照IlluminaHiseq2500测序仪操作指南进行上机测序，上级样本的终浓度为10pM；（4）测序结果的处理和注释IlluminaHiseq2500测序所得的序列集，通过去接头、去掉低质量序列及去污染等过程完成数据的初步过滤，得到干净序列；将获得的干净序列与miRBase、Genebank、UCSC、NONCODE和Rfam数据库进行比对，获得两组样本的小RNA分类与注释结果；将所有小RNA片段注释后，用剩下的未注释片段进行新miRNA预测；（5）样本miRNA表达量将所得的测序数据通过与miRNA的生物信息数据库（miRBase20.0）进行比较，获取miRNA的表达信息。相比现有技术，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术通过高通量测序技术，对尿液标本外泌体miRNA分析处理，获取miRNA的表达信息；通过建立IgA肾病患者和健康对照者的数据库，得到两种尿液标本外泌体miRNA的差异表达情况，利用靶基因功能预测深入研究差异表达的miRNA,深入研究这些差异表达的miRNA将有助于进一步阐明IgA肾病的发病及致病机理。为IgA肾病的诊断提供新的方法及理论基础。2、本专利技术方法设计合理可行，能够有效的建立一种无创的精准的差异表达的miRNA方法，为临床诊治工作提供新的思路。3、该方法操作方便，检测数据可靠。4、建立了一种新的肾病的分析方法，该方法采用尿液标本分析外泌体miRNA表达情况，是一种无创的分析方法。所得数据直接与数据库进行比对分析，能够快速获得分析结果。附图说明图1为IgA肾病组高通量测序所得干净小RNA片段的分类与注释图；图2为健康对照组高通量测序所得干净小RNA片段的分类与注释图；图3IgA肾病组与健康对照组的尿液外泌体miRNA差异表达聚类分析图。具体实施方式以下通过具体实施例并结合附图，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。除了特别指明，以下实施例中所使用的技术手段和操作方法为本领域技术人员所熟知的常规手段和方法，所使用原料均为市售商品。1、尿液标本的收集本实施例分别选取3例临床已被诊断为IgA肾病患者及年龄相近的健康体检者，分别收集120ml的晨尿，作为IgA肾病组和健康对照组用于后续实验操作。6例标本均来自南昌大学第二附属医院，临床已确诊，排除具有其他能引起肾小球疾病及并发症的患者，所有IgA肾病尿液标本均在治疗和用药前收集。2、外泌体及其总RNA的提取将收集的尿液标本按以下离心步骤提取外泌体：先依次按400g，2000g和10000g离心力分别离心10min，20min和30min，以去除尿液标本中的细胞及细胞碎片等大颗粒，收集上清液；然后利用超高速离心机以200000g离心力离心之前收集的上清液，时间为1小时，弃上清得胶状沉淀；最后用PBS缓冲液重悬沉淀，再次200000g离心1小时；收集沉淀，加入Trizol试剂，-80℃保存以备RNA提取。分别将按上述步骤得到的两组实验组样本同组等量混合，提取样本总RNA，步骤如下：常温下解冻样本，加入0.2ml/1mlTrizol氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，4℃12000g离心15min；吸取上层水相，加入0.5ml/1mlTrizol异丙醇，室温放置10min，4℃12000g离心10min；去上清，用1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃7500g离心5min；去沉淀，干燥8min，加入RNA溶解液，-80℃保存备用。利用Agilent2200TapeStation和ND-1000Nanodrop仪器对提取的RNA样品进行浓度及质量检测。3、cDNA文库的建立及Illumina测序上述质检通过的样品，以1μg起始量，用Illumina公司配套的TruSeqRSmallRNASamplePrepKit进行文库构建，步骤如下：先对RNA进行3’端和5’端连接修饰，然后利用逆转录试剂合成第一链cDNA，利用PCR扩增得到DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种尿液外泌体miRNA的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）尿液标本的收集：收集个体人的晨尿120ml作为尿液标本；（2）外泌体及其总RNA的提取：将收集的尿液标本按以下离心步骤提取外泌体：先依次按400g、2000g和10000g离心力分别离心10min、20min和30min，以去除尿液标本中的细胞及细胞碎片等大颗粒，收集上清液；然后利用超高速离心机以200000g离心力离心之前收集的上清液，时间为1小时，弃上清得胶状沉淀；然后用PBS缓冲液重悬沉淀，再次200000g离心1小时；收集沉淀，加入Trizol试剂，‑80℃保存以备RNA提取；提取样本总RNA：常温下解冻样本，加入0.2ml/1mlTrizol氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2‑3min，4℃ 12000g离心15min；吸取上层水相，加入0.5ml/1mlTrizol异丙醇，室温放置10min，4℃ 12000g离心10min；去上清，用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃ 7500g离心5min；去沉淀，干燥8min，加入RNA溶解液，‑80℃保存备用；利用Agilent 2200 TapeStation和ND‑1000 Nanodrop仪器对提取的RNA样品进行浓度及质量检测；（3）cDNA文库的建立及Illumina测序：以1μg起始量，用Illumina公司配套的TruSeqR Small RNA Sample Prep Kit进行文库构建：先对RNA进行3’端和5’端连接修饰，然后利用逆转录试剂合成第一链cDNA，利用PCR扩增得到DNA产物，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出小分子DNA，最终获得高通量测序DNA文库，并用Agilent 2200 TapeStation对文库进行质检；将制备的文库按照Illumina Hiseq 2500测序仪操作指南进行上机测序，上级样本的终浓度为10pM；（4）测序结果的处理和注释Illumina Hiseq 2500测序所得的序列集，通过去接头、去掉低质量序列及去污染等过程完成数据的初步过滤，得到干净序列；将获得的干净序列与miRBase、Genebank、UCSC、NONCODE和Rfam数据库进行比对，获得两组样本的小RNA分类与注释结果；将所有小RNA片段注释后，用剩下的未注释片段进行新miRNA预测；（5）样本miRNA表达量将所得的测序数据通过与miRNA的生物信息数据库（miRBase20.0）进行比较，获取miRNA的表达信息。...

【技术特征摘要】
1.一种尿液外泌体miRNA的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）尿液标本的收集：收集个体人的晨尿120ml作为尿液标本；（2）外泌体及其总RNA的提取：将收集的尿液标本按以下离心步骤提取外泌体：先依次按400g、2000g和10000g离心力分别离心10min、20min和30min，以去除尿液标本中的细胞及细胞碎片等大颗粒，收集上清液；然后利用超高速离心机以200000g离心力离心之前收集的上清液，时间为1小时，弃上清得胶状沉淀；然后用PBS缓冲液重悬沉淀，再次200000g离心1小时；收集沉淀，加入Trizol试剂，-80℃保存以备RNA提取；提取样本总RNA：常温下解冻样本，加入0.2ml/1mlTrizol氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，4℃12000g离心15min；吸取上层水相，加入0.5ml/1mlTrizol异丙醇，室温放置10min，4℃12000g离心10min；去上清，用1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃7500g离心5min；去沉淀，干燥8min，加入RNA溶解液，-80℃保存备用；利用Agilent2200TapeStation和ND-1000Nanodrop仪器对提取的RNA样品进行浓度及质量检测；（3）cDNA文库的建立及Illumina测序：以1μg起始量，用Illumina公司配套的TruSeqRSmallRNASamplePrepKit进行文库构建：先对RNA进行3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄波，王小中，邹叶青，刘静，徐颜美，闵清华，
申请(专利权)人：南昌大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：江西;36