本发明专利技术公开了一种快速检测细菌整合子的LAMP试剂盒，所述的试剂盒包括：10×LAMP缓冲液；10mM dNTPs；50μM钙黄绿素；8000U/mLBst DNA聚合酶；外引物组(1‑F3、1‑B3；2‑F3、2‑B3；3‑F3、3‑B3)；内引物组(1‑FIP、1‑BIP；2‑FIP、2‑BIP；3‑FIP、3‑BIP)；无菌去离子水。本发明专利技术试剂盒具有简便快速、特异性强、灵敏度高的优点，可根据反应结束后颜色的差异，即可进行结果判定，适合现场快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种快速检测细菌整合子的LAMP试剂盒及其应用。
技术介绍
近年来由于抗生素的广泛应用及不合理的使用，导致细菌的耐药问题越来越严重，多重耐药现象也日益普遍。细菌有多种耐药机制，大量研究表明整合子对细菌多重耐药性具有重要影响。整合子是一种可移动基因元件，包括位点特异性重组功能的基因决定簇，在整合酶的作用下能捕获外来耐药基因，在整合子中可形成多种耐药基因的组合、排列。在抗生素广泛应用背景下，整合子通过捕获各种耐药基因，使耐药性在细菌之间广泛传播，临床中出现的多重耐药细菌与整合子对耐药基因的积累具有密切关联。整合子根据其整合酶基因序列的不同而分类。其中，I类整合子在多重耐药细菌中最为常见，它与Tn21转座子家族相关；II类整合子以Tn7及其家族为代表，与I类整合子有46％的同源性；III类整合子与I类整合子有61％的同源性，目前只发现碳青霉烯耐药基因位于该整合子上。鉴于整合子在细菌获得耐药性中所起的重要作用，开展整合子检测与分类对于进一步探究细菌耐药性与耐药机制具有重要意义。目前对细菌整合子的检测主要使用常规的PCR方法，该方法不仅需要复杂的仪器设备，且扩增产物需通过琼脂糖凝胶电泳与测序分析，费时较长，成本高，不适合进行批量化快速检测。因此亟需研发操作简便、准确快速的检测技术。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的分子检测方法，其特点是利用链置换型DNA聚合酶在等温条件下可以特异地大量扩增靶序列。此外，LAMP扩增产物可通过荧光染料实现可视化判定。因此，LAMP技术具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等诸多优势。为快速、准确检测细菌整合子提供了新方法。
技术实现思路
针对现有技术中的不足，本专利技术进行了深入研究，提供了一种快速检测细菌整合子的LAMP试剂盒及其应用。本专利技术另一目的在于提供一种用于检测细菌整合子的LAMP引物组。本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种快速检测细菌整合子的LAMP试剂盒，包括：10×LAMP缓冲液；10mMdNTPs；50μM钙黄绿素；8000U/mLBstDNA聚合酶；外引物组(1-F3、1-B3；2-F3、2-B3；3-F3、3-B3)；内引物组(1-FIP、1-BIP；2-FIP、2-BIP；3-FIP、3-BIP)；无菌去离子水。所述的10×LAMP缓冲液含有200mMTris-HCl(pH8.8，25℃)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1％的曲拉通X-100。所述的LAMP检测引物序列如下所示，其中外引物和内引物的摩尔浓度比为1：8。本专利技术LAMP反应条件为：65℃恒温反应50min，并在80℃持续10min。本专利技术的结果判定方法为：反应结束后用肉眼观察，阳性菌株颜色变为绿色，阴性菌株颜色为橙色。本专利技术所述的整合子为I类整合子、II类整合子和III类整合子。相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：本研究提供了一种针对细菌整合子的LAMP检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒及检测方法可用于细菌整合子的快速检测与分型。本专利技术试剂盒具有简便快速、特异性强、灵敏度高的优点，此外本专利技术试剂盒实现了结果判定可视化，根据反应结束后颜色的差异，即可判定结果，非常适合现场快速检测。附图说明图1为细菌整合子LAMP检测电泳图。图中，泳道M为DL-5000DNAMarker；泳道1为I类整合子阳性菌株沙门氏菌SAL；泳道2为II类整合子阳性菌株大肠杆菌EC；泳道3为III类整合子阳性菌株粘质沙雷氏菌SM；泳道4为阴性对照。图2(A)为LAMP方法I类整合子敏感性试验电泳图。图中，泳道M为DL-5000DNAMarke，泳道1-7分别表示DNA量为6.6×104pg/反应，6.6×103pg/反应，6.6×102pg/反应，6.6×101pg/反应，6.6×100pg/反应，6.6×10-1pg/反应，6.6×10-2pg/反应，泳道8为阴性对照。图2(B)为LAMP方法II类整合子敏感性试验电泳图。图中，泳道M为DL-5000DNAMarke，泳道1-7分别表示DNA量为4.3×104pg/反应，4.3×103pg/反应，4.3×102pg/反应，4.3×101pg/反应，4.3×100pg/反应，4.3×10-1pg/反应，4.3×10-2pg/反应，泳道8为阴性对照。图2(C)为LAMP方法III类整合子敏感性试验电泳图。图中，泳道M为DL-5000DNAMarke，泳道1-7分别表示DNA量为9.2×104pg/反应，9.2×103pg/反应，9.2×102pg/反应，9.2×101pg/反应，9.2×100pg/反应，9.2×10-1pg/反应，9.2×10-2pg/反应，泳道8为阴性对照。图3(A)为目视法判定I类整合子阳性结果的示意图。图3(B)为目视法判定II类整合子阳性结果的示意图。图3(C)为目视法判定III类整合子阳性结果的示意图。图3(D)为目视法判定I、II、III类整合子均为阴性结果的示意图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，以下所述，仅是对本专利技术的较佳实施例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的
技术实现思路
加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均在本专利技术的保护范围内。实施例1细菌整合子三重LAMP检测方法的建立1、供试菌株整合子阳性菌株沙门氏菌SAL(含I类整合子)、大肠杆菌EC(含II类整合子)和粘质沙雷氏菌SM(含III类整合子)均由江苏省家禽科学研究所保存提供。2、LAMP引物组设计根据GenBank中的细菌整合子(I、II、III)基因序列，通过分析后按照LAMP反应原理进行引物组的设计，结果优化得到6对引物，其中1-F3和1-B3为I类整合子LAMP检测外引物，1-FIP和1-BIP为I类整合子LAMP检测内引物；2-F3和2-B3为II类整合子LAMP检测外引物，2-FIP和2-BIP为II类整合子LAMP检测内引物；3-F3和3-B3为III类整合子LAMP检测外引物，3-FIP和3-BIP为III类整合子LAMP检测内引物。具体序列如表1所示。表1细菌整合子LAMP检测引物序列3、LAMP扩增模板制备采用煮沸法提取细菌DNA：取过夜培养菌液1mL，12000rpm离心3min，弃去上清；加入1mL1×PBS缓冲液，12000rpm离心3min，尽量弃净上清液；重复以上步骤一遍；向管底加入100μL无菌超纯水，剧烈涡旋混匀，100℃加热10min，然后迅速冷却(置于冰箱-20℃环境中)10min；8000rpm离心5min，将上清液转移至新的离心管中，置于-20℃保存备用。4、LAMP检测试剂的配制(1)10×LAMP缓冲液：包含200mMTris-HCl(pH8.8，25℃)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1％的曲拉通X-100。(2)10mMdNTPs；(3)50μM钙黄绿素试剂；(4)8000U/mLBstD本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测细菌整合子的LAMP试剂盒，所述的试剂盒包括：LAMP缓冲液；dNTPs；钙黄绿素；Bst DNA聚合酶；外引物组：1‑F3、1‑B3；2‑F3、2‑B3；3‑F3、3‑B3；内引物组：1‑FIP、1‑BIP；2‑FIP、2‑BIP；3‑FIP、3‑BIP；无菌去离子水，优选的，所述的试剂盒包含或者不包含其它引物。
【技术特征摘要】
1.一种快速检测细菌整合子的LAMP试剂盒，所述的试剂盒包括：LAMP缓冲液；dNTPs；钙黄绿素；BstDNA聚合酶；外引物组：1-F3、1-B3；2-F3、2-B3；3-F3、3-B3；内引物组：1-FIP、1-BIP；2-FIP、2-BIP；3-FIP、3-BIP；无菌去离子水，优选的，所述的试剂盒包含或者不包含其它引物。2.根据权利要求1所述的一种快速检测细菌整合子的LAMP试剂盒，其特征在于：所述的LAMP缓冲液含有包含200mMTris-HCl、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁、8M甜菜碱和体积百分浓度为1％的曲拉通X-100。3.根据权利要求1所述的一种快速检测细菌整合子的LAMP试剂盒，其特征在于：所述引物序列如下所示：4.根据权利要求1所述的一种快速检测细菌整合子的LAM...
【专利技术属性】
技术研发人员：窦新红，龚建森，盛中伟，庄林林，王成明，高宏平，张笛，束婧婷，许明，邹剑敏，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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