鲬和李氏*的快速鉴别试剂盒及鉴别方法技术

鲬和李氏的快速鉴别试剂盒及鉴别方法，所述试剂盒包括碱基序列为SEQ ID No.1/2的引物对，以及限制性内切酶HinfI或其同切酶。本发明专利技术提供了一种基于PCR反应-限制性酶切分型的试剂盒产品，并提供基于此的鲬/李氏快速鉴别方法，在扩增受检个体COI片段的基础上，采用限制性内切酶酶切的方法，使不同物种产生特异性酶切图谱，根据图谱中条带的大小判断受检个体的分类归属，避免了扩增后的测序过程，是针对鲬/李氏的稳定性高、快速准确、成本低廉的鉴别方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属渔业资源调查鱼类的鉴别
，尤其涉及鲬和李氏快速鉴别方法。背景介绍鲬是我国的重要经济鱼种之一，在中国渔业经济中占有重要地位。鲬属鲉形目鲬科，为近海底层鱼类，成体体长一般为200～350mm，其幼鱼在外形上与鲈形目科的李氏十分相似。这两种鱼分类地位不同，成鱼形态差异明显，幼鱼却因形态相似不易分辨。实际的海洋渔业资源拖网调查中往往能同时捕获大量的鲬幼体和李氏成体，其体长多在80～120mm之间，根据传统的分类方法不易区分二者，导致渔业资源信息统计错误，甚至Genbank中亦有将李氏序列误作为鲬序列公布的情况，这对于渔业资源的有效利用、可持续发展和系统研究产生负面影响，尤其是对于作为重要经济种类的鲬资源管理利用和相关研究十分不利。目前，鲬和李氏的分类通常使用两类方法：形态学方法及基因序列法。常规的形态学分类主要通过以下两点区分鲬和李氏1)第一背鳍：鲬第一背鳍与第二背鳍紧邻，背鳍鳍式为I，VIII；李氏第一背鳍与第二背鳍分开，背鳍鳍式为IV；2)棘或小刺：鲬的前鳃盖骨后下角有2棘，李氏前鳃盖骨棘末端上缘有3小刺。如果渔获物形态完整，通过仔细分辨第一背鳍、棘或小刺可区分体长相仿的鲬幼鱼和李氏由于拖网、保存和运输过程中的外力破坏，经常出现一部分形态特征受损甚至个体残缺的不完整渔获样品，无法从形态特征对其种类进行鉴别。近年来许多外形相似的渔获种类都利用基因序列进行鉴别分类，该方法主要是对受检对象线粒体中的COI片段进行扩增、测序，利用DNA中碱基序列的特异性进行物种区分鉴别，该方法虽然准确，但耗时长、花费高，需动用大型实验设备。因此，开发一种快速、准确、成本低廉的方法来鉴别鲬幼鱼与李氏是很有必要的。
技术实现思路
为了克服形态分类鉴定方法的不准确性以及基因序列分类耗时长、花费高等不足，本专利技术旨在建立一种稳定性高、快速准确、成本低廉的方法对鲬和李氏进行区分鉴别。为实现上述目的，本专利技术首先提供一种鲬和李氏的快速鉴别试剂盒，该试剂盒中包括碱基序列为SEQIDNo.1/2的引物对，以及限制性内切酶HinfI或其同切酶。序列为SEQIDNo.1的正向引物：F5’-caaccacaaagacattggcacyctc-3’；序列为SEQIDNo.2的反向引物：R5’-tagacttctgggtggccaaaga-3’。其中所述的限制性内切酶HinfI或其同切酶的酶切位点为5'…G▼ANTC…3'的限制性内切酶。另一方面，本专利技术提供一种鲬和李氏的快速鉴别方法，包括对样品总DNA进行PCR扩增的步骤，所述PCR扩增引物对的碱基序列为SEQIDNo.1/2：序列为SEQIDNo.1的正向引物：F5’-caaccacaaagacattggcacyctc-3’；序列为SEQIDNo.2的反向引物：R5’-tagacttctgggtggccaaaga-3’。进一步地，本专利技术所述的鲬和李氏的快速鉴别方法中还包括对PCR产物酶切的步骤，所述的酶切步骤使用限制性内切酶HinfI或其同切酶。这些限制性内切酶的酶切位点为5'…G▼ANTC…3'的限制性内切酶。本专利技术在扩增受检个体COI片段的基础上，采用限制性内切酶酶切的方法，使不同物种产生特异性酶切图谱，根据图谱中条带的大小判断受检个体的分类归属，避免了扩增后的测序过程，建立了针对鲬/李氏的稳定性高、快速准确、成本低廉的鉴别方法，其有益效果具体包括：1.不受形态特征影响：能够针对形态特征不明显或外力造成形体损伤等无法利用传统形态法分类的个体进行鉴定。2.不受个体发育阶段限制：排除了时空限制、遗传因素等造成的表型差异，从DNA分子水平上提供可靠的分类依据。3.准确快速、成本低廉：与传统形态分类法相比，利用DNA分子手段鉴定更为科学、准确；与常规的DNA检测技术相比，直接对PCR产物进行酶切40min即可电泳检测得出结果，无需测序，节省时间且降低成本。附图说明本专利技术附图1幅：鲬及李氏聚合酶链式反应-酶切分型琼脂糖凝胶电泳图谱，图中：M：DL2000DNAMarker；D1、D2：试剂盒法提取的李氏DNA；D3、D4：试剂盒法提取的鲬DNA；P1、P2：李氏PCR扩增产物；P3、P4：鲬PCR扩增产物；H1、H2：李氏PCR扩增后HinfI酶切产物；H3、H4：鲬PCR扩增后HinfI酶切产物。具体实施方式本专利技术是在PCR扩增受检样品COI片段的基础上，采用限制性内切酶对PCR产物进行酶切的方法，使不同物种来源的待测样品产生特异性的酶切图谱，并可根据图谱中条带的大小判断待测样品的分类来源。本专利技术首先提供一种鲬和李氏的快速鉴别试剂盒，该试剂盒中包括碱基序列为SEQIDNo.1/2的引物对，以及限制性内切酶HinfI或其同切酶。该所述的试剂盒，可以用于下述本专利技术的鲬和李氏的快速鉴别方法的任意具体实施方式。所述的鉴别方法，基本地包括对样品总DNA进行PCR扩增的步骤，所述PCR扩增引物对的碱基序列为SEQIDNo.1/2：序列为SEQIDNo.1的正向引物：F5’-caaccacaaagacattggcacyctc-3’；序列为SEQIDNo.2的反向引物：R5’-tagacttctgggtggccaaaga-3’。进一步地，本专利技术所述的鲬和李氏的快速鉴别方法中还包括对上述PCR产物酶切的步骤，所述的酶切步骤使用限制性内切酶HinfI或其同切酶。这些限制性内切酶的酶切位点为5'…G▼ANTC…3'的限制性内切酶。更为具体地，本专利技术的鲬和李氏的快速鉴别方法包括如下步骤：a.提取样品总DNA；b.PCR扩增：以步骤a所提取的样品总DNA为模板，使用引物SEQIDNo.1/2进行PCR扩增；c.使用限制性内切酶HinfI或其同切酶对步骤b所得PCR扩增产物进行酶切；d.对步骤c所得酶切产物进行电泳检测；e.结果判定。本专利技术的方法中，首先提取待检测样品的总DNA，具体实施方式中，步骤a优选使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒进行。然后本专利技术利用一对引物SEQIDNo.1/2，通过PCR的方法扩增COI基因的一段DNA片段，并继而以限制性内切酶HinfI或其同切酶对PCR产物进行酶切，以得到特异性的酶切图谱。所述的PCR扩增可采用本领域常规体系，优选的PCR的扩增参数包括94℃预变性2min；94℃30s,58℃30s,72℃1min，30个循环；本文档来自技高网...

【技术保护点】
鲬和李氏的快速鉴别试剂盒，其特征在于包括碱基序列为SEQ ID No.1/2的引物对，以及限制性内切酶HinfI或其同切酶。

【技术特征摘要】
1.鲬和李氏的快速鉴别试剂盒，其特征在于包括碱基序列为SEQID
No.1/2的引物对，以及限制性内切酶HinfI或其同切酶。
2.鲬和李氏的快速鉴别方法，包括对样品总DNA进行PCR扩增的步骤，
其特征在于，PCR扩增引物对的碱基序列为SEQIDNo.1/2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括PCR产物酶切的步骤，
所述的酶切步骤使用限制性内切酶HinfI或其同切酶。
4.根据权利要求3所述的方法，包括如下步骤：
a.提取样品总DNA；
b.PCR扩增：以步骤a所提取的样品总DNA为模板，使用引物SEQID
No.1/2进行PCR扩增；
c.使用限制性内切酶HinfI或其同切酶对步骤b所得PCR扩增产物进行酶
切；
d.对步骤c所得酶切产物进行电泳检测；
e.结果判定。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤a使用海洋动物
组织基因组DNA提取试剂盒提取待测...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍相渤，刘卫东，王彬，赫崇波，刘修泽，苏浩，李玉龙，
申请(专利权)人：辽宁省海洋水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21