检测肿瘤化疗个体化用药相关基因的方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种检测肿瘤化疗个体化用药相关基因的方法和试剂盒。与现有技术相比，本发明专利技术具有以下优点：1)使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂；2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用；3)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即不需要经过任何形式的信号转换)，因此，理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别，从而具有高的灵敏度；4)质谱技术还有自动化、高通量检测等特点，因此，质谱技术与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多个基因位点，从而大大减少了工作量，提高了检测通量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及多重PCR扩增技术和基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALDI-TOF-MS)。且更具体而言，本专利技术涉及检测肿瘤化疗个体化用药相关基因的方法和试剂盒。
技术介绍
化疗药物是对恶性肿瘤所致疾病的治疗药物。这些药物能作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，破坏肿瘤细胞的细胞周期，抑制或杀死肿瘤细胞。比如5-氟尿嘧啶、顺铂等一线化疗药物通过干扰肿瘤细胞DNA合成、破坏肿瘤细胞DNA等机制杀灭肿瘤细胞。化疗药物治疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一。临床使用的抗肿瘤化疗药物均有不同程度的毒副作用，它们在杀伤肿瘤细胞的同时，又杀伤正常组织的细胞。毒副反应是限制化疗药物剂量或使用的直接原因。化疗的疗效与病人个体差异(病人对化疗药物敏感程度以及对药物的耐受程度)及药物本身的毒性反应有关。近年来，大量临床研究表明每一种化疗药物都有与其对应的评估其作用的靶标，化疗药物的疗效主要与相关基因的多态性和表达水平相关，如CDA基因多态性影响吉西他滨的疗效，UGT1A1与伊立替康的毒副作用相关等。这些基因的表达水平和多态性可以能够帮助医生为患者评估各类化疗药物的毒副作用风险，为患者制定毒副作用最小、疗效最佳的化疗方案。具体的个体化用药相关基因如下：1、吉西他滨的个体化用药相关基因吉西他滨是一种破坏细胞复制的二氟核苷类抗代谢抗肿瘤药，在临床上广泛用于非小细胞肺癌的一线治疗，同时对于包括胰腺癌、胆囊癌、乳腺癌和平滑肌肉瘤等在内的其他许多实体瘤具有活性。但是该药的治疗窗小，易引发以骨髓抑制为主的不良反应。CDA基因多态性会影响吉西他滨的药代动力学，通过损害CDA对吉西他滨的解毒功能，导致药物毒副作用增加，CDA活性减弱的癌症患者在接受吉西他滨治疗时易导致更高毒性发生。CDA存在两种基因多态性，79A>C和208G>A，其突变型会导致CDA活性减弱，使肿瘤患者在接受吉西他滨治疗时易发生更高的毒副作用。2、铂类药物(顺铂、卡铂、奥沙利铂)的个体化用药相关基因铂类药物(顺铂、卡铂、奥沙利铂)是临床上最常用的周期非特异性抗肿瘤药物，作用的主要靶点为DNA。铂类药物进入细胞，与肿瘤细胞内DNA结合形成Pt-DNA加合物导致DNA结构改变DNA复制、转录障碍，造成肿瘤细胞死亡。铂类药物耐药机制主要包括：DNA修复能力增强、药物解毒增加、减少药物摄取积聚、机体对铂类-DNA络合物的耐受性提高等，涉及多种基因、蛋白和信号转导通路。研究表明XRCC1(c.580C>T，c.1196A>G)和GSTP1(c.313A>G)基因突变与用药效果密切相关。XRCC1参与因电离辐射和氧化损伤引起的BER(碱基切除修复途径)和单键断裂修复，对维持基因的稳定性起着关键作用同时与铂类药物抵抗有关。谷胱甘肽转移酶P1(GSTP1)是细胞抗损伤抗癌变的主要解毒系统。GSTP1基因多态性的存在可引起其表达的相应酶的活性不同导致解毒功能发生改变与铂类化疗的疗效密切相关。GSTP1基因上的第5外显子的105位点的遗传多态性A>G转换影响了GSTP1蛋白的活性，导致GST对铂类药物的生物转化能力降低，从而提高了临床获益率。3、氟尿嘧啶类用药的个体化用药相关基因氟尿嘧啶类药物是以抗代谢物而起作用，在细胞内转化为有效的氟尿嘧啶脱氧核苷酸后，通过阻断脱氧核糖尿苷酸受细胞内胸苷酸合成酶转化为胸苷酸，而干扰DNA的合成。氟尿嘧啶同样可以干扰RNA的合成。二氢嘧啶脱氢酶(DPD)是5-Fu代谢过程中的关键酶，DPD酶活性在人群中存在个体差异，且受DPD酶基因(DPYD)多态性的影响。DPYD基因1905+1G>A突变几乎完全局限于DPD酶活性低的患者，该酶活性缺乏可导致5-Fu体内清除受阻，半衰期显著延长，分解减弱而合成增加，细胞毒性也相应增强。FDA建议在服用5-Fu药物前进行DPYD基因多态性的检测。MTHFR还原5,10-亚甲基四氢叶酸为5-甲基四氢叶酸，前者是胸苷酸合成的重要原料之一，参与DNA的合成与修复；后者是体内主要的甲基供体，参与DNA甲基化。MTHFR基因677C→T的突变使223位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸→MTHFR酶活性降低→5,10-MTHFR浓度提高：5-FdUMP与5,10-MTHFR、TS形成稳定的共价络合物，干扰DNA的合成和修复，提高5-FU抗肿瘤效果。4、长春新碱的个体化用药相关基因长春碱类药物能干扰增殖细胞纺锤体的形成，使有丝分裂停止在中期，在较高剂量下，能直接破坏染色体，使微管蛋白质结晶化，阻止其装配。为细胞周期特异性药物，作用于M期，并对M期有延缓作用，其显效快，缓解期短。此外，长春碱类药物还有免疫抑制作用。体外研究已表明长春碱类药物是ABCB1的底物。P-糖蛋白(P-glycopretein，P-gp)为ATP结合盒B亚家族1转运蛋白(ATP-bindingcassettesubfamilyBmember1，ABCB1)基因编码的跨膜转运蛋白P-gp，具有能量依赖的跨膜药物外输泵功能，可将细胞内底物包括多种抗肿瘤药物泵出胞外使胞内药物积聚浓度下降。由多药耐药基因(MDR1)编码的P-gp的高表达，导致药物外排增加是多药耐药发生的主要机制。药物基因组学和药物遗传学研究显示MDR1基因多态性可改变P-gp的表达或活性，进而引起多药耐药。在ABCB1基因上的1199、2677以及3435三个位点的变化均会导致该基因的mRNA表达降低，从而降低了药物泵出细胞的速率，增加了药物的敏感性，降低耐药性。5、紫杉醇的个体化用药相关基因紫杉醇类是一种新型的抗微管药物，与微管蛋白结合，通过促进细胞在其分裂间期形成不典型的微管框架并阻止微管正常的生理性解聚，使快速分裂的肿瘤细胞在有丝分裂期内被牢牢限制在这一框架内，最后因复制受到阻断而死亡。为细胞周期特异性药物，主要作用于G2晚期和M期。抗瘤谱广，治疗指数高，并具有放射增敏作用。紫杉类药物为P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的转运底物。ABCB1的基因多态性可以影响其表型遗传因素，也可能参与了ABCB1表达的调控。P-糖蛋白(P-glycopretein，P-gp)为ATP结合盒B亚家族1转运蛋白(ATP-bindingcassettesubfamilyBmember1，ABCB1)基因编码的跨膜转运蛋白P-gp，具有能量依赖的跨膜药物外输泵功能，可将细胞内底物包括多种抗肿瘤药物泵出胞外使胞内药物积聚浓度下降。MDR1基因上的1236位点上的TT型和3435位点上的TT型均会降低该基因的mRNA表达，降低了用药效果。6、他莫昔芬的个体化用药相关基因他莫昔芬是一种选择性雌激素受体调节剂，常用于乳腺癌的辅助治疗，可降低47％的复发和26％的死亡率。他莫昔芬被CYP450酶代谢为活性N-去甲基他莫昔芬及4-羟他莫昔芬，4-羟他莫昔芬进一步被CYP2D6代谢为活性产物4-羟-N-去甲基他莫昔芬(Endoxifen)，后者与雌激素受体亲和力高，抑制雌激素依赖性乳腺癌细胞增殖能力是他莫昔芬的30-100倍。CYP2D6基因变异导致CYP2D6酶活性下降或酶活性受到抑制时，血浆中活性产物Endoxifen将明显下降。研究表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测肿瘤化疗个体化用药相关基因的方法，其中，所述肿瘤化疗个体化用药相关基因包括选自UGT1A1‑G211A、MTHFR‑C677T、MDR1‑G2677T/A、XRCC1‑A1196G、MDR1‑G1199A、CYP2C19‑G681A、CDA‑G208A、CYP2C9‑A1075C、CYP2D6‑C100T、XRCC1‑C27157T、CYP2C19‑G636A、CYP19A1‑G161T、MDR1‑C3435T、GSTP1‑A313G、UGT1A1‑C686A、MDR1‑C1236T、DPYD‑G1905+1A和CDA‑A79G/C中的一种或多种；优选地，所述肿瘤化疗个体化用药相关基因包括UGT1A1‑G211A、MTHFR‑C677T、MDR1‑G2677T/A、XRCC1‑A1196G、MDR1‑G1199A、CYP2C19‑G681A、CDA‑G208A、CYP2C9‑A1075C、CYP2D6‑C100T、XRCC1‑C27157T、CYP2C19‑G636A、CYP19A1‑G161T、MDR1‑C3435T、GSTP1‑A313G、UGT1A1‑C686A、MDR1‑C1236T、DPYD‑G1905+1A和CDA‑A79G/C；更优选地，所述肿瘤化疗个体化用药相关基因由UGT1A1‑G211A、MTHFR‑C677T、MDR1‑G2677T/A、XRCC1‑A1196G、MDR1‑G1199A、CYP2C19‑G681A、CDA‑G208A、CYP2C9‑A1075C、CYP2D6‑C100T、XRCC1‑C27157T、CYP2C19‑G636A、CYP19A1‑G161T、MDR1‑C3435T、GSTP1‑A313G、UGT1A1‑C686A、MDR1‑C1236T、DPYD‑G1905+1A和CDA‑A79G/C组成，所述方法包括：1)PCR扩增引物的制备：PCR扩增引物为根据所选择的待检测的个体化用药相关基因设计的特异性针对每种基因的扩增引物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列，所述扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17‑25个碱基，在5'端具有标签序列，以区分扩增引物与延伸引物；2)质谱延伸引物的制备：所述质谱延伸引物的长度为15‑28个碱基并且其3'端位于个体化用药相关基因突变位点的在延伸方向上的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为个体化用药相关基因突变位点；3)检测模板的制备：提取待测样本DNA；4)以步骤3)中提取的DNA为模板，使用步骤1)中的所述PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物；5)通过SAP酶处理，除去步骤4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP；6)以步骤5)中获得的扩增产物为模板，使用步骤2)中的所述质谱延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物；7)纯化步骤6)中获得的延伸产物；8)将纯化后的产物在质谱仪上进行质谱检测，所得到的质谱峰图通过分析软件进行分析，得到分型结果。...

【技术特征摘要】
1.一种检测肿瘤化疗个体化用药相关基因的方法，其中，所述肿瘤化疗个体化用药相关基因包括选自UGT1A1-G211A、MTHFR-C677T、MDR1-G2677T/A、XRCC1-A1196G、MDR1-G1199A、CYP2C19-G681A、CDA-G208A、CYP2C9-A1075C、CYP2D6-C100T、XRCC1-C27157T、CYP2C19-G636A、CYP19A1-G161T、MDR1-C3435T、GSTP1-A313G、UGT1A1-C686A、MDR1-C1236T、DPYD-G1905+1A和CDA-A79G/C中的一种或多种；优选地，所述肿瘤化疗个体化用药相关基因包括UGT1A1-G211A、MTHFR-C677T、MDR1-G2677T/A、XRCC1-A1196G、MDR1-G1199A、CYP2C19-G681A、CDA-G208A、CYP2C9-A1075C、CYP2D6-C100T、XRCC1-C27157T、CYP2C19-G636A、CYP19A1-G161T、MDR1-C3435T、GSTP1-A313G、UGT1A1-C686A、MDR1-C1236T、DPYD-G1905+1A和CDA-A79G/C；更优选地，所述肿瘤化疗个体化用药相关基因由UGT1A1-G211A、MTHFR-C677T、MDR1-G2677T/A、XRCC1-A1196G、MDR1-G1199A、CYP2C19-G681A、CDA-G208A、CYP2C9-A1075C、CYP2D6-C100T、XRCC1-C27157T、CYP2C19-G636A、CYP19A1-G161T、MDR1-C3435T、GSTP1-A313G、UGT1A1-C686A、MDR1-C1236T、DPYD-G1905+1A和CDA-A79G/C组成，所述方法包括：1)PCR扩增引物的制备：PCR扩增引物为根据所选择的待检测的个体化用药相关基因设计的特异性针对每种基因的扩增引物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列，所述扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17-25个碱基，在5'端具有标签序列，以区分扩增引物与延伸引物；2)质谱延伸引物的制备：所述质谱延伸引物的长度为15-28个碱基并且其3'端位于个体化用药相关基因突变位点的在延伸方向上的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为个体化用药相关基因突变位点；3)检测模板的制备：提取待测样本DNA；4)以步骤3)中提取的DNA为模板，使用步骤1)中的所述PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物；5)通过SAP酶处理，除去步骤4)获得的扩增产物中含有的...

【专利技术属性】
技术研发人员：董新波，刘琦，赵金银，方楠，于闯，许立志，李杰，
申请(专利权)人：北京京诺玛特科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11