一种检测皮肤癌相关标志物的探针组合及其试剂盒制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种检测皮肤癌相关标志物的探针组合及其试剂盒。本发明专利技术提供的皮肤癌相关的标志物选自12种miRNA，所述标志物与皮肤癌密切相关；本发明专利技术提供所探针组合物包括捕获探针和信号放大组合物，所述的探针组合物特异性、准确度、灵敏度皆良好，能够实现对目标标志物的准确检测，且重复性好。本发明专利技术提供的试剂盒还包括信号放大探针，本发明专利技术提供的方法采用原位杂交方法，通过级联放大体系提高信号强度，采用本发明专利技术提供的试剂盒和方法能够在8h内完成对样品的检测，提高了检测效率。

A probe combination for detecting skin cancer related markers and a kit thereof

The invention belongs to the field of molecular biology, relating to medicine and biological technology, in particular to a probe combination for detecting skin cancer related markers and a kit thereof. The invention provides the related signs of skin cancer were selected from 12 kinds of miRNA, the marker and skin cancer are closely related; the invention provides a composition comprising a probe capture probe and signal amplification composition, the composition of the probe specificity, accuracy and sensitivity are good, can achieve accurate detection of target markers. And good repeatability. The kit also includes a signal amplifying probe, the invention provides a method of using in situ hybridization method, through the cascade amplification system to improve signal strength, kit and method provided by the invention can complete the detection of samples in the range of 8h, improve the detection efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种检测皮肤癌相关标志物的探针组合及其试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种检测皮肤癌相关标志物的探针组合及其试剂盒。
技术介绍
MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，通过碱基互补配对的方式识别靶miRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶miRNA或者阻遏靶miRNA的翻译。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。皮肤癌包括鳞状细胞癌、基底细胞癌、恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、特发性出血性肉瘤、汗腺癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、血管肉瘤等。其中常见的是鳞状细胞癌和基底细胞癌。目前，研究结果表明，多种miRNA在皮肤癌细胞或临床样本中呈过表达或下调表达，且发现有些miRNA能够诱导形成皮下肿瘤。基于miRNA的表达与皮肤癌的相关性，miRNA可以作为皮肤癌相关的标志物，通过对miRNA表达的检测，实现对皮肤癌的早期诊断和治疗。目前，针对miRNA的检测方法主要有NorthernBlot、基因芯片、荧光定量探针法、基于微球的流式细胞术技术。但NorthernBlot方法敏感度低、耗时长且RNA的用量较大，不适合高通量分析；基因芯片技术能实现miRNA的高通量分析，即在一块芯片上同时检测多个miRNA，但缺点是结果准确性低，重复性差，实验价格昂贵；荧光定量探针法检测灵敏度高，但检测费用昂贵；而基于微球的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中，更有利于捕获miRNA序列，因此提高了准确性，但是由于miRNA同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。原位杂交技术是一种定位和形态学检测保存的组织切片或细胞制备物中特异性miRNA序列的方法。然而目前现有技术中对miRNA的多重平行检测仍存在许多困难。首先，需要分别制备各靶miRNA的标记探针；其次，难以同时原位检测多种靶miRNA的表达。因此，目前报道的对多种miRNA的检测只能用不同的标记方法，然而，用不同的标记方法不能很好地控制探针与细胞中非特异性序列可能的交叉杂交。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的皮肤癌相关microRNA检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。一种探针组合物，其特征在于，所述探针组合物能够检测皮肤癌相关标志物，所述标志物选自hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-21-5p或hsa-miR-365a-3p中一种或以上。所述探针组合物，其特征在于，包括捕获探针：所述捕获探针的核苷酸序列自5’端至3’端依次为P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述P1序列与权利要求1所述的标志物特异性结合；在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5个～10个T。在其中一个实施例中，所述P1序列选自SEQIDNO:1～12，所述P2序列选自SEQIDNO:13～24。在其中一个实施例中，所述的探针组合物，其特征在于，所述捕获探针选自以下序列：自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:1、5个T、SEQIDNO:13；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:2、5个T、SEQIDNO:14；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:3、5个T、SEQIDNO:15；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:4、5个T、SEQIDNO:16；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:5、5个T、SEQIDNO:17；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:6、5个T、SEQIDNO:18；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:7、5个T、SEQIDNO:19；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:8、5个T、SEQIDNO:20；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:9、5个T、SEQIDNO:21；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:10、5个T、SEQIDNO:22；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:11、5个T、SEQIDNO:23；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:12、5个T、SEQIDNO:24。本专利技术的另一目的是提供一种皮肤癌相关标志物检测试剂盒，其特征在于，包含上述的捕获探针和信号放大组合物。所述一种皮肤癌相关标志物检测试剂盒，其特征在于，所述信号放大组合物为：一级信号放大探针，在一级信号放大探针的5’端修饰荧光基团；或一级信号放大探针，二级信号放大探针，在二级信号放大探针的3’端修饰荧光基团；或一级信号放大探针、二级信号放大探针，三级信号放大探针，在三级信号放大探针的5’端修饰荧光基团；针对所述捕获探针中的任一种，所述一级信号放大探针与所述捕获探针特异性结合；针对所述一级信号放大探针中的任一种，所述二级信号放大探针与所述一级信号放大探针特异性结合；针对所述二级信号放大探针中的任一种，所述三级信号放大探针与所述二级信号放大探针特异性结合。本专利技术提供的一种皮肤癌相关标志物检测试剂盒，其另一特征在于，所述：一级信号放大探针自5’端至3’端依次为P4序列、间隔臂序列、P3序列；二级信号放大探针自5’端至3’端依次为P5序列、间隔臂序列、P6序列；三级信号放大探针自5’端至3’端依次为P8序列、间隔臂序列、P7序列；所述P3序列与P2序列特异性结合；所述P5序列与P4序列特异性结合；所述P6序列与P7序列特异性结合；所述间隔臂序列独立的为2个～20个T；所述P8序列为5个T。在其中一个实施例中，所述P4序列选自SEQIDNO:25～36；所述P6序列选自SEQIDNO:49～60。在其中一个实施例中，所述荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705或AlexaFluor488，且针对不同捕获探针的信号放大探针上修饰的荧光基团互不相同。本专利技术的主要优点在于：(1)原位杂交方法本身具有荧光信号灵敏度低的缺点，但是本专利技术采用新型的原位杂交方法所设计的检测试剂盒，通过信号放大体系提高荧光信号强度。本专利技术检测流程能够在8h内完成，单一拷贝的核酸杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高miRNA原位杂交的检测灵敏度，此外，由于多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。(2)本专利技术所选择的信号放大探针，是专利技术人经过大量试验进行综合评估、统计分析、多种参数的优化组合而得出的。本专利技术方法采用多重信号放大探针，该探本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种探针组合物，其特征在于，所述探针组合物能够检测皮肤癌相关标志物，所述标志物选自hsa‑miR‑375、hsa‑miR‑149‑3p、hsa‑miR‑221‑3p、hsa‑miR‑222‑3p、hsa‑miR‑34a‑5p、hsa‑miR‑199a‑5p、hsa‑miR‑137、hsa‑miR‑182‑5p、hsa‑miR‑125b‑5p、hsa‑miR‑31‑5p、hsa‑miR‑21‑5p或hsa‑miR‑365a‑3p中一种或以上。

【技术特征摘要】
1.一种探针组合物，其特征在于，所述探针组合物能够检测皮肤癌相关标志物，所述标志物选自hsa-miR-375、hsa-miR-149-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-137、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-21-5p或hsa-miR-365a-3p中一种或以上。2.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，包括捕获探针：所述捕获探针的核苷酸序列自5’端至3’端依次为P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述P1序列与权利要求1所述的标志物特异性结合；所述间隔臂序列为5个～10个T。3.根据权利要求2所述的探针组合物，其特征在于，所述P1序列选自SEQIDNO:1～12，所述P2序列选自SEQIDNO:13～24。4.根据权利要求3所述的探针组合物，其特征在于，所述捕获探针选自以下序列：自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:1、5个T、SEQIDNO:13；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:2、5个T、SEQIDNO:14；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:3、5个T、SEQIDNO:15；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:4、5个T、SEQIDNO:16；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:5、5个T、SEQIDNO:17；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:6、5个T、SEQIDNO:18；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:7、5个T、SEQIDNO:19；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:8、5个T、SEQIDNO:20；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:9、5个T、SEQIDNO:21；自5’端至3’端顺序连接的SEQIDNO:10、5个T、SEQIDNO:22；自5’端至3’端顺序连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘苏燕，吴诗扬，董艳，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44