肿瘤组织冻存、复苏试剂盒及其处理方法技术

本发明专利技术涉及活肿瘤组织的处理技术领域，提供了活肿瘤组织冻存、复苏试剂盒及其处理方法。本发明专利技术的冻存、复苏试剂盒包括了组织玻璃化液与复苏液，各种所含成分完全清楚且稳定可控，没有添加血清类物质，保质期长，批次间稳定性好，可直接应用于活组织冻存、复苏，无需稀释或自行配制，简化了操作。本发明专利技术可以使肿瘤组织冻存、复苏保持较高活率，并且保存了肿瘤组织的原始特性，移植后可使之以原代肿瘤的形态增殖或传代，且保存了肿瘤的原始基因突变，扩宽了肿瘤组织样本的应用范围，更好地为临床科研服务。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤组织的处理
，具体地说，是肿瘤组织冻存、复苏试剂盒及其处理方法。
技术介绍
活体组织特别是活肿瘤组织，具有重要的科研和临床应用价值，活组织保存技术是实现这些价值的基础。常用的活肿瘤组织保存方法主要为建立PDX肿瘤模型保存和冻存。建立PDX肿瘤模型保存，耗时耗力，程序繁琐，费用昂贵，且经过多次传代后，肿瘤组织容易发生变异，肿瘤组织异质性丧失，失去保存的价值。活肿瘤组织冻存即将组织置于低温环境中保存，以使组织暂时脱离生长状态，保存肿瘤组织的特性。这样的保存方式省心省力，操作简便，且成本低廉。在需要的时候才将组织复苏移植，使之以原代肿瘤形态增殖，很好地保存了肿瘤的原始突变，可获得分子、细胞、组织及体内等多水平的全面的肿瘤信息数据。目前的活肿瘤组织冻存方式一般为直接冻存，组织冻存液一般由DMSO、血清、细胞培养液组成，需要现用现配。但是由于血清的成分不定，冻存液的稳定性差，使得这种组织冻存液的保质期较短，保存条件也较为苛刻。使用现有的组织冻存液冻存肿瘤组织时，只有极少数的肿瘤组织可以复苏或以肿瘤细胞的形式进行传代，更无法以原代肿瘤的形态增殖，且极易丢失肿瘤的原始突变，只能获得分子水平的数据信息。故而，现有的组织冻存液的应用范围狭窄，降低了肿瘤组织样本的应用价值和科研转化能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供活肿瘤组织冻存、复苏试剂盒及其处理方法。本专利技术的冻存、复苏试剂盒包括了组织玻璃化液与复苏液，各种所含成分完全清楚且稳定可控，没有添加血清类物质，保质期长，批次间稳定性好，可直接应用于活肿瘤组织冻存、复苏，无需稀释或自行配制，简化了操作。本专利技术的第一方面，提供了肿瘤组织冻存试剂盒，包括：(1)玻璃化液1，其组分包括：含有DMEM65～95V/V％，DMSO5.5～20V/V％，EG 3.5～15V/V％，BSA 0.5～4w/v％，蔗糖1～5w/v％，甲基纤维素4000CP0.05～0.8w/v％，羟乙基淀粉0.25～0.6w/v％，葡萄糖15～35w/v％。(2)玻璃化液2，其组分包括：含有DMEM65～95V/V％，DMSO5.5～20V/V％，EG 8～20V/V％，BSA 0.5～4w/v％，蔗糖10～20w/v％，甲基纤维素4000CP0.05～0.8w/v％，PVP0.25～0.6w/v％，葡萄糖15～35w/v％。进一步的，所述玻璃化液1的组分包括：DMEM80V/V％，DMSO 10V/V％，EG10V/V％，BSA3w/v％，蔗糖1w/v％，甲基纤维素4000CP0.05w/v％，羟乙基淀粉0.25w/v％，葡萄糖25w/v％。进一步的，所述玻璃化液2的组分包括：DMEM70V/V％，DMSO18V/V％，EG12V/V％，BSA 3w/v％，蔗糖20w/v％，甲基纤维素4000CP0.05w/v％，PVP0.25w/v％，葡萄糖30w/v％。进一步的，所述肿瘤组织冻存试剂盒还包括肿瘤组织处理模具，所述肿瘤组织处理模具包括：一底座，所述底座的上表面设有凹陷部，自所述底座的上表面垂直向下，沿横向设有多条等距分布的、深度低于凹陷部最低点的切刀导向槽。进一步的，所述切刀导向槽的深度低于凹陷部最低点1.8-2.3mm，优选2.0mm。进一步的，所述切刀导向槽沿横向等距分布，相邻两条切刀导向槽之间的间距1mm，切刀导向槽的数量为12条。进一步的，所述凹陷部呈椭圆体，宽16mm、长25mm；所述凹陷部最低点到底座上表面的垂直距离为8.5mm。本专利技术的第二方面，提供了肿瘤组织复苏试剂盒，包括：(1)复苏液1，其组分包括：含有DMEM65～85V/V％，1XPBS15～35V/V％，BSA1～3w/v％，蔗糖10～40w/v％，葡萄糖15～35w/v％。(2)复苏液2，其组分包括：含有DMEM65～85V/V％，1XPBS15～35V/V％，BSA1～3w/v％，蔗糖10～20w/v％，葡萄糖15～35w/v％。(3)复苏液3，其组分包括：DMEM75～95V/V％，1XPBS5～25V/V％，BSA1～3w/v％，葡萄糖15～35w/v％组成。进一步的，所述复苏液1的组分包括：DMEM65V/V％，1XPBS35V/V％，BSA2w/v％，蔗糖40w/v％，葡萄糖25w/v％。进一步的，所述复苏液2的组分包括：DMEM75V/V％，1XPBS25V/V％，BSA2w/v％，蔗糖20w/v％，葡萄糖25w/v％。进一步的，所述复苏液3的组分包括：DMEM95V/V％，1XPBS5V/V％，BSA2w/v％，葡萄糖15w/v％组成。本专利技术的第三方面，提供了采用上述试剂盒对肿瘤组织进行冻存的处理方法，包括如下步骤：a.在肿瘤组织用运输液冰上运输至处理间时，用生理盐水冲洗三遍，修剪除去血管、包膜、坏死组织等，用肿瘤组织处理模具将肿瘤组织进行切片，并用生理盐水再次清洗；b.将切片后的肿瘤组织浸入玻璃化液1，浸入时间20-30min；c.将步骤b的肿瘤组织浸入玻璃化液2，浸入时间10-20min或者待肿瘤组织沉至管底，玻璃化液2的温度为室温；d.尽量沥干肿瘤组织，将肿瘤组织平铺于金属网的网面上，浸入液氮，浸入时间为大于5min；e.将肿瘤组织迅速移入冻存管内，于液氮罐中保存。进一步的，所述步骤a中将肿瘤组织进行切片，切片成大小为1x5x5mm。进一步的，所述步骤b，具体包括：将切片后的肿瘤组织浸入10ml玻璃化液1，浸入时间25min，玻璃化液1的温度为室温。进一步的，所述步骤d，具体包括：将步骤b的肿瘤组织浸入10ml玻璃化液2，浸入时间15min或者待肿瘤组织沉至管底，玻璃化液2的温度为室温。本专利技术的第四方面，提供了采用上述试剂盒对肿瘤组织进行复苏的处理方法，包括如下步骤：a.将从液氮中取出的肿瘤组织迅速浸入复苏液1，浸入时间2-5min，复苏液1的温度为36-38℃；b.将肿瘤组织浸入复苏液2，浸入时间3-8min；c.将肿瘤组织浸入复苏液3，浸入时间8-15min；d.再取与步骤c相同量的复苏液3，将肿瘤组织移入其中，处理时间10min，即得复苏后的肿瘤组织。进一步的，所述步骤a，具体包括：将从液氮中取出的肿瘤组织迅速浸入10ml复苏液1，浸入时间3min，复苏液1的温度为37℃。进一步的，所述步骤b，具体包括，将肿瘤组织浸入复苏液2，浸入时间5min，复苏液2的温度为室温。进一步的，所述步骤c，具体包括：将肿瘤组织浸入10ml复苏液3，浸入时间10min，复苏液3的温度为室温。本专利技术可以使肿瘤组织冻存、复苏的活率在85％以上，进一步使冻存、复苏的肿瘤组织可以与新鲜获得的肿瘤组织具有同样的组织学、遗传学特征并维持肿瘤的异质性，能够使冻存、复苏的肿瘤组织同新鲜获取的一样进行相关的实验研究，以获得分子、细胞、组织及体内等多水平的全面的肿瘤信息数据。本专利技术的玻璃化液同时含有渗透性和非渗透性低温保护剂，可以明显阻止冰晶的生长，可以有效形成低温玻璃化冻存结果。本专利技术的玻璃化冻存体系同时考虑了低温保护剂毒性、渗透性和玻璃化能力，使肿瘤组织不至于被迅速冰晶化而影响肿瘤组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤组织冻存试剂盒，包括：(1)玻璃化液1，其组分包括：DMEM65～95V/V％，DMSO5.5～20V/V％，EG 3.5～15V/V％，BSA 0.5～4w/v％，蔗糖1～5w/v％，甲基纤维素4000CP0.05～0.8w/v％，羟乙基淀粉0.25～0.6w/v％，葡萄糖15～35w/v％；(2)玻璃化液2，其组分包括：含有DMEM65～95V/V％，DMSO5.5～20V/V％，EG 8～20V/V％，BSA 0.5～4w/v％，蔗糖10～20w/v％，甲基纤维素4000CP0.05～0.8w/v％，PVP0.25～0.6w/v％，葡萄糖15～35w/v％。

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤组织冻存试剂盒，包括：(1)玻璃化液1，其组分包括：DMEM65～95V/V％，DMSO5.5～20V/V％，EG 3.5～15V/V％，BSA 0.5～4w/v％，蔗糖1～5w/v％，甲基纤维素4000CP0.05～0.8w/v％，羟乙基淀粉0.25～0.6w/v％，葡萄糖15～35w/v％；(2)玻璃化液2，其组分包括：含有DMEM65～95V/V％，DMSO5.5～20V/V％，EG 8～20V/V％，BSA 0.5～4w/v％，蔗糖10～20w/v％，甲基纤维素4000CP0.05～0.8w/v％，PVP0.25～0.6w/v％，葡萄糖15～35w/v％。2.根据权利要求1所述的肿瘤组织冻存试剂盒，其特征在于：所述玻璃化液1的组分包括：DMEM80V/V％，DMSO 10V/V％，EG10V/V％，BSA3w/v％，蔗糖1w/v％，甲基纤维素4000CP0.05w/v％，羟乙基淀粉0.25w/v％，葡萄糖25w/v％；所述玻璃化液2的组分包括：DMEM70V/V％，DMSO18V/V％，EG12V/V％，BSA 3w/v％，蔗糖20w/v％，甲基纤维素4000CP0.05w/v％，PVP0.25w/v％，葡萄糖30w/v％。3.根据权利要求1所述的肿瘤组织冻存试剂盒，其特征在于：所述肿瘤组织冻存试剂盒还包括肿瘤组织处理模具，所述肿瘤组织处理模具包括：一底座，所述底座的上表面设有凹陷部，自所述底座的上表面垂直向下，沿横向设有多条等距分布的、深度低于凹陷部最低点的切刀导向槽。4.根据权利要求3所述的肿瘤组织冻存试剂盒，其特征在于：所述切刀导向槽的深度低于凹陷部最低点1.8-2.3mm，相邻两条切刀导向槽之间的间距1mm。5.根据权利要求3所述的肿瘤组织冻存试剂盒，其特征在于：所述凹陷部呈椭圆体，宽16mm，长25mm；所述凹陷部最低点到底座上表面的垂直距离为8.5mm。6.一种肿瘤组织复苏试剂盒，包括：(1)复苏液1，其组分包括：含有DMEM65～85V/V％，1XPBS15～35V/V％，BSA1～3w/v％，蔗糖10～40w/v％，葡萄糖15～35w/v％；(2)复苏液2，其组分包括：含有DMEM65～85V/V％，1XPBS15～35V/V％，BSA1～3w/v％，蔗糖10～20w/v％，葡萄糖15～35w/v％。(3)复苏液3，其组分包括：DMEM75～95V/V％，1XPBS5～25V/V％，BSA1～3w/v％，葡萄糖15～35w/v％组成。7.根据权利要求3所述的肿瘤组织复苏试剂盒，其特征在于：所述复苏液1的组分包括：DMEM65V/V％，1XPBS35V/V％，BSA2w/v％，蔗糖40w/v％，葡萄糖25w/v％；所述复苏液2的组分包括：DMEM75V/V％，1XPBS25V/V％，BSA2w/v％，蔗糖20w/v％，葡萄糖25w/v％；所述复苏液3的组分包括：DMEM95V/V％，1XPBS5V/V％，BSA2w/v％，葡萄糖15w/v％组成。8.一种肿瘤组织冻存和复苏试剂盒，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴红平，曾敏，周徐，金晓芳，杨秋蕊，
申请(专利权)人：上海赛立维生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31