本发明专利技术提供一种汗腺样细胞的冻存液及复苏液，其是在血清替代物中添加以下组分配制而成：人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL；重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为10-100ng/mL；三碘甲状腺原氨酸，浓度为10-50ng/mL；半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5-1μg/mL；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL；牛血清白蛋白，浓度为0.01-1g/mL。本发明专利技术还提供了一种利用该冻存液和复苏液的细胞冻存复苏方法，与传统冻存复苏方法相比，采用本发明专利技术提供的方法，冻存复苏存活率高，不影响汗腺样细胞的特性，也不会改变其汗腺样细胞分化状态，解决了汗腺样细胞储存复苏困难的问题。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种汗腺样细胞的冻存液及复苏液，其是在血清替代物中添加以下组分配制而成：人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL；重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为10-100ng/mL；三碘甲状腺原氨酸，浓度为10-50ng/mL；半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5-1μg/mL；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL；牛血清白蛋白，浓度为0.01-1g/mL。本专利技术还提供了一种利用该冻存液和复苏液的细胞冻存复苏方法，与传统冻存复苏方法相比，采用本专利技术提供的方法，冻存复苏存活率高，不影响汗腺样细胞的特性，也不会改变其汗腺样细胞分化状态，解决了汗腺样细胞储存复苏困难的问题。【专利说明】
本专利技术涉及人体汗腺再生研究领域，更具体地，涉及一种令汗腺样细胞可以保持活性的冻存复苏的方法，及该方法中应用的冻存液和复苏液。
技术介绍
皮肤是人体最大的器官，可排出机体25%的热量以保持体温相对恒定。大面积深度烧伤患者因汗腺被毁或其分泌管道被瘢痕组织堵塞而丧失了分泌汗液的功能，皮肤的体温调节功能障碍，严重影响患者的生活质量。因此，恢复大面积深度烧伤患者的排汗功能对于提高患者生活质量意义重大。目前研制出的人工皮肤均无汗腺等皮肤附属器，无法解决这一问题。间充质干细胞向汗腺细胞分化与汗腺细胞种植的研究为此带来了希望。但诱导后汗腺样细胞冻存复苏后存活效率低，只有30%左右，不利于复苏应用。目前，在细胞冻存时可用的冻存液包括血清和血清替代物两类，由于血清具有成分不明确、质量不稳定、价格昂贵等缺点，利用血清替代物进行细胞冻存和复苏已成为发展趋势。特别是临床应用级细胞的储存，血清的成分复杂性使得若将其应用于临床尚存在很多未知的风险，因此临床上普遍使用血清替代物作为细胞冻存液。常规的血清替代物冻存液主要成分是70%的无血清培养基、20%牛血清白蛋白和10% 二甲基亚砜。一般采用简单的两步法降温冻存，具体方法是:将血清替代物冻存液加入细胞悬液后放入冻存管中，置于_80°C冰箱过夜后转入液氮中保存。对冻存细胞复苏时，一般是将冻存管直接置于37°C迅速解冻，再加入完全生长培养基重悬细胞，离心后弃去上清，加入生长培养基继续培养。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种令汗腺样细胞可以保持活性的冻存复苏的方法，及该方法中应用的冻存液和复苏液。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案:一种汗腺样细胞冻存液，其是在作为基础液的血清替代物中添加以下组分配制而成:人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL;重组人角质细胞生长因子-1I，浓度为lO-lOOng/mL ;三碘甲状腺原氨酸，浓度为10_50ng/mL ;半琥珀酸氢化可的松,浓度为0.5-1 μ g/mL ;胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL ;牛血清白蛋白，浓度为 0.01-lg/mL。如上所述的冻存液，优选地，所述人表皮生长因子的浓度为60_90ng/mL ;所述重组人角质细胞生长因子-1I的浓度为20-60ng/mL ;所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为20-40ng/mL ;所述半琥拍酸氢化可的松的浓度为0.6-0.9 μ g/mL ;所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.03-0.15mL/mL ;所述牛血清白蛋白的浓度为0.1-0.8g/mL。如上所述的冻存液，更优选地，所述人表皮生长因子的浓度为70_80ng/mL ;所述重组人角质细胞生长因子-1I的浓度为30-50ng/mL ;所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为25-30ng/mL ;所述半琥拍酸氢化可的松的浓度为0.7-0.8 μ g/mL ;所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.05-0.lmL/mL ;所述牛血清白蛋白的浓度为0.3-0.6g/mL。如上所述的冻存液，优选地，所述血清替代物为Knock-out血清替代物(Knock-out Serum Replacement, Invitrogen 公司，美国)。一种汗腺样细胞复苏液，其是在作为基础液的血清替代物中添加以下组分配制而成:人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL;重组人角质细胞生长因子-1I，浓度为lO-lOOng/mL ;三碘甲状腺原氨酸,浓度为10_50ng/mL ;半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5-1 μ g/mL ;胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL ;牛血清白蛋白，浓度为 0.01-lg/mL。如上所述的复苏液，优选地，所述人表皮生长因子的浓度为60-90ng/mL;所述重组人角质细胞生长因子-1I的浓度为20-60ng/mL ;所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为20-40ng/mL ;所述半琥拍酸氢化可的松的浓度为0.6-0.9 μ g/mL ;所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.03-0.15mL/mL ;所述牛血清白蛋白的浓度为0.1-0.8g/mL。如上所述的复苏液，更优选地，所述人表皮生长因子的浓度为70_80ng/mL ;所述重组人角质细胞生长因子-1I的浓度为30-50ng/mL ;所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为25-30ng/mL ;所述半琥拍酸氢化可的松的浓度为0.7-0.8 μ g/mL ;所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.05-0.lmL/mL ;所述牛血清白蛋白的浓度为0.3-0.6g/mL。如上所述的复苏液，优选地，所述血清替代物为Knock-out血清替代物。一种保持细胞活性的冻存方法，其特征在于，将待冻存的细胞消化收集离心后，加入如上所述的冻存液，令细胞浓度为0.5-2 XlOVmL,以1.5mL/支移至冻存管中，置4°C预冷30分钟，放入程序降温仪中以每分钟降l°c的速度均匀梯度降温至-80°c、转移至液氮中长期保存。如上所述的冻存方法，优选地，将细胞降温至_80°C 16小时后再转移至液氮中长期保存。一种保持细胞活性的复苏方法，其特征在于，将冻存的细胞从液氮中取出，在40±3°C水浴中解冻1-3分钟，加入2-5倍体积已经37°C预热的如上所述的复苏液重悬。如上所述的复苏方法，优选地，在重悬后以600-1000rpm/min离心2_3分钟去除上清。一种保持细胞活性的冻存复苏方法，其特征在于，冻存时，将待冻存的细胞消化收集离心后，加入如上所述的冻存液，令细胞浓度为0.5-2X 106/mL，以1.5mL/支移至冻存管中，置4°C预冷30分钟，放入程序降温仪中以每分钟降l°c的速度均匀梯度降温至-80°c、转移至液氮中长期保存；复苏时，将冻存的细胞从液氮中取出，在40±3°C水浴中迅速解冻1-3分钟，加入2-5倍体积已经37°C预热的如上所述的复苏液重悬。如上所述的冻存复苏方法，优选地，将细胞降温至-80°C 16小时后再转移至液氮中长期保存。如上所述的冻存 复苏方法，优选地，在重悬后以600-1000rpm/min离心2_3分钟去 除上清。本专利技术的有益效果为:本专利技术涉及一种汗腺样细胞经冻存和复苏仍保持活力的方法，并对冻存液成份、复苏液成份及冻存程序、复苏程序进行了改进和优化。本专利技术的冻存液及复苏液具有成分明确、容易使用、稳定性好的优点。而采用本专利技术方法，冻存复苏存活率高，实验证明，汗腺样细胞的存活率可从现本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种汗腺样细胞冻存液，其特征在于，其是在血清替代物中添加以下组分配制而成：人表皮生长因子，浓度为50?100ng/mL；重组人角质细胞生长因子?Ⅱ，浓度为10?100ng/mL；三碘甲状腺原氨酸，浓度为10?50ng/mL；半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5?1μg/mL；胰岛素?转铁蛋白?亚硒酸钠，浓度为0.01?0.2mL/mL；牛血清白蛋白，浓度为0.01?1g/mL。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：付小兵，马奎，黄沙，盛志勇，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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