一种卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法及其使用的复苏液技术

本发明专利技术提供了一种卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法及其使用的复苏液，所述卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法包括卵母细胞或胚胎快速冷冻过程和复苏过程，所述复苏过程包括：复苏前，先将复苏液和培养装置预热，将预热好的1号复苏液注入到培养装置中，并放在显微镜下；取出载体管，将卵母细胞或胚胎排出到1号复苏液中；将卵母细胞或胚胎在1号复苏液中均衡，在复苏基础液中均衡两次；将卵母细胞或胚胎进行洗脱，然后转移到新鲜的培养基中；所述1号复苏液的蔗糖浓度大于所述2号复苏液的蔗糖浓度。本发明专利技术的技术方案能够更好地保护卵母细胞或胚胎，有效地提高卵母细胞或胚胎经过快速玻璃化冷冻后的复苏存活率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种细胞冷冻保存的方法，尤其涉及一种卵母细 胞或胚胎冻存复苏的方法及其使用的复苏液。
技术介绍
对于卵母细胞或胚胎，目前主要是采用程序化冷冻的方法进行冷冻保存，但是这 种方法在冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，并伴随造成生物性损伤， 比如慢速冷冻过程中形成冰晶、冷冻保护剂对细胞的毒性以及渗透压压力等都会卵母细胞 或胚胎造成伤害，采用这种方法即使卵母细胞或胚胎成功复苏但是其全能性也会受损害。 近几年随着科学技术的发展，玻璃化快速冷冻因为在快速降温冷冻过程中不形成 冰晶而受到大家的关注。玻璃化是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程，玻璃态固 体分子之间的关系和液态无明显区别，在降温冷冻过程中不形成冰晶，细胞结构不会受到 破坏从而细胞得以存活，是一种理想的冷冻保存途径。所述玻璃化快速冷冻方法业内通常 简称为快速冷冻。 目前玻璃化快速冷冻和复苏的方法主要是围绕小鼠或牛羊等胚胎进行的研宄，而 对于一些数量少而且敏感的细胞，如卵母细胞或胚胎，研宄较少；而且现有的公开文献中报 道的存活率都不高。实际上，存活率的高低会直接影响到细胞保存的价值。 对于这种玻璃化快速冷冻和复苏方法，细胞存活率的高低除了与所用的冷冻试剂 和复苏试剂有关，还与具体的冷冻和复苏方法有很大关系。
技术实现思路
针对上述现有技术中卵母细胞或胚胎经过快速冷冻后复苏存活率不高的问题，本 专利技术提供了一种卵母细胞或胚胎快速快速冷冻和复苏的方法及其使用的复苏液，以达到提 高卵母细胞或胚胎经过快速冷冻后复苏存活率的目的。 对此，本专利技术提供了一种卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，包括卵母细胞或胚胎 快速冷冻过程和复苏过程，所述复苏过程包括以下步骤： 步骤1):在将玻璃化冷冻保存的卵母细胞或胚胎取出复苏前，先将2号复苏液预 热达到25-27°C，注入到培养装置A中，得到2号复苏液A;然后将预热达到25-27°C的复苏 基础液注入到培养装置B和培养装置C中，分别得到复苏基础液B和复苏基础液C;将1号 复苏试剂保持密封进行预热，并将培养装置预热，预热温度均为36~39°C，预热时间大于 30min;将预热好的1号复苏液注入到预热好的培养装置中，并将培养装置放在显微镜下； 步骤2):取出载体管，并将含有卵母细胞或胚胎的部分浸入到1号复苏液中，将含 有卵母细胞或胚胎的混合液排出到1号复苏液中； 步骤3):将1号复苏液注入到2号复苏液A的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入 到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置2~5min; 步骤4):将1号复苏液注入到复苏基础液B的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入 到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置3~lOmin; 步骤5):将1号复苏液注入到复苏基础液C的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入 到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置3~lOmin; 步骤6):将卵母细胞或胚胎进行洗脱，然后转移到新鲜的培养基中； 所述步骤6)后，将卵母细胞或胚胎在培养基中培养2-4小时后，即可进行 ICSI(卵泡浆内单精子显微注射）和胚胎转化； 所述1号复苏液和2号复苏液均为包含了鹿糖的复苏基础液，所述1号复苏液的 蔗糖摩尔浓度大于所述2号复苏液的蔗糖摩尔浓度，这样，卵母细胞或胚胎在1号复苏液中 均衡后，转移到浓度较小的2号复苏液中均衡，逐步适应和平衡。所述1号复苏液和2号复 苏液可采用现有技术的常规复苏液，满足所述1号复苏液的蔗糖浓度大于所述2号复苏液 的蔗糖浓度；所述复苏基础液可采用现有技术常规的复苏基础液。所述2号复苏液A为预 热达到25-27°C的2号复苏液，该预热后的2号复苏液放置于培养装置A中，命名为2号复 苏液A;所述复苏基础液B为预热达到25-27°C并注入到培养装置B的复苏基础液；所述复 苏基础液C为预热达到25-27°C并注入到培养装置C的复苏基础液。 采用本技术方案，多次的、缓慢的将卵母细胞或胚胎在复苏液中进行均衡，能更好 地保护卵母细胞或胚胎，有效地提高卵母细胞或胚胎经过快速玻璃化冷冻后的复苏存活 率，并且保持冷冻复苏后卵母细胞或胚胎的生长分化和表达能力等全能性不受影响。 所有浸入操作在显微镜下操作，可以减少错误，减少对卵母细胞或胚胎的伤害。 作为本专利技术的进一步改进，所述步骤2)取出载体管后，打开载体管的密封部分， 将载体管含有卵母细胞或胚胎的一端置于1号复苏试剂上方2~5s，浸入到1号复苏试剂 中，并使载体管含有卵母细胞或胚胎的一端完全浸入到复苏试剂中，载体管的浸入角度为 相对于水平面20°至30°，整个浸入操作在显微镜下操作；然后，将载体管的另一端堵住， 载体管里的溶液就从载体管中流出到1号复苏试剂中，或者采用移液装置从载体管的另一 端加入空气排除含有卵母细胞或胚胎的溶液。 采用此技术方案，便于载体管中卵母细胞或胚胎的快速排除，而不对敏感的卵母 细胞或胚胎造成损害。 作为本专利技术的进一步改进，所述卵母细胞或胚胎快速冷冻过程包括以下步骤： 步骤A:将卵母细胞或胚胎在36~39°C预热的冷冻液中平衡； 步骤B:将卵母细胞或胚胎载入到载体管中； 步骤C:将装载了卵母细胞或胚胎的载体管保持水平状态靠近液氮蒸汽层至距离 液氮液面5~10mm，将载体管以载体管一端为圆心向液氮液面进行旋转至竖直于液氮液 面，并使载体管中装载了细胞的部分浸入到液氮中，旋转时间不大于5s;将载体管密封放 入到液氮中保存。 采用此技术方案，采用步骤C的方法让装载了卵母细胞或胚胎的载体管旋转，使 其先接触液氮蒸汽，然后再渐渐的接触液氮液面，直至完全浸入到液氮中，让卵母细胞或胚 胎逐渐适应低温的液氮环境，减少对卵母细胞或胚胎的损害，有利于提高卵母细胞或胚胎 经过玻璃化冷冻后的复苏存活率。 作为本专利技术的进一步改进，所述步骤A包括以下分步骤： 步骤A):将36~39°C预热的冷冻基础液滴在培养装置上，得到第一液滴；将36~ 39°C预热的1号冷冻液滴在第一液滴的旁边，得到第二液滴；将卵母细胞或胚胎转移至第 一液滴的液体底部，等待5~30s;然后将第一液滴和第二液滴联通形成第一液体桥，等待 2~5min;将36~39°C预热的1号冷冻液滴在所述第一液体桥的旁边，得到第三液滴；将 卵母细胞或胚胎转移至所述第一液体桥上；将第三液滴与所述第一液体桥联通形成第二液 体桥，等待2~5min; 步骤B):将36~39°C预热的1号冷冻液滴在培养装置的空处，得到第四液滴，将 卵母细胞或胚胎转移至第四液滴的顶部，保持静置，均衡6~12min; 步骤C):将36~39°C预热的2号冷冻液滴两份在培养装置的空处，分别得到第五 液滴和第六液滴，所述第五液滴和第六液滴之间留有空隙；将卵母细胞或胚胎转移至第五 液滴上，混合15~30s;再将含有卵母细胞或胚胎的混合液转移至第六液滴上，混合15~ 30s； 其中，所述1号冷冻液和2号冷冻液均为包含相同冷冻基础液的冷冻液，所述1号 冷冻液中冷冻基础液的体积含量大于所述2号冷冻液中冷冻基础液的体积含量，即所述1 号冷冻液中其他物质的浓度小当前第1页1 2 3 4 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卵母细胞或胚胎冻存复苏的方法，其特征在于：包括卵母细胞或胚胎的快速冷冻过程和复苏过程，所述复苏过程包括以下步骤：步骤1）：在玻璃化冷冻保存的卵母细胞或胚胎复苏前，先将2号复苏液预热达到25‑27℃，注入到培养装置A中，得到2号复苏液A；然后将预热达到25‑27℃的复苏基础液注入到培养装置B和培养装置C中，分别得到复苏基础液B和复苏基础液C；将1号复苏液保持密封进行预热，并将培养装置预热，预热温度均为36~39度，预热时间大于30min，将预热好的1号复苏液注入到预热好的培养装置中，并将培养装置放在显微镜下；步骤2）：取出载体管，并将含有卵母细胞或胚胎的部分浸入到1号复苏液中，将含有卵母细胞或胚胎的混合液排出到1号复苏液中；步骤3）：将1号复苏液注入到2号复苏液A的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置2~5min；步骤4）：将1号复苏液注入到复苏基础液B的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置3~10min；步骤5）：将1号复苏液注入到复苏基础液C的底部，将卵母细胞或胚胎转移注入到1号复苏液的上面，然后再在卵母细胞或胚胎的上面注入1号复苏液，静置3~10min；步骤6）：将卵母细胞或胚胎进行洗脱，然后转移到新鲜的培养基中；所述1号复苏液的蔗糖摩尔浓度大于所述2号复苏液的蔗糖摩尔浓度。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林小贞，吴洁，常海龙，咖博·瓦吉塔，
申请(专利权)人：深圳普若赛斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44