MDCK细胞的冻存和复苏，它涉及MDCK细胞的冻存和复苏。本发明专利技术的冻存方法为：通过限制冻存液在与细胞混合中的加入速率，防止细胞损坏，并通过调整降温速率，防止细胞内产生冰晶，导致细胞死亡。并在细胞复苏中，快速进行复苏，保证了细胞的完整性，存活率。本发明专利技术的方法能够很好的保持MDCK细胞活力。本发明专利技术的复苏后的细胞活力达95％以上，保证了细胞质量，使其长期存活。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细胞的冻存和复苏。
技术介绍
细胞的深低温保存是困扰低温生物学研究领域的复杂难题。细胞连接在组织中的部位、结构和功能特殊，其对冷冻损伤的反应及冷冻损伤的保护机制也应具有其特殊性。因此，有必要对深低温保存中的细胞连接损伤特点和规律进行系统观察和研究，建立针对性的、有效的深低温保存技术方案，提高和保证组织和器官的深低温保存效果。研究表明，细胞连接可能是深低温保存过程中各种损伤因子作用靶点之一，并导致组织结构的损伤与破坏。首先，细胞连接通过跨细胞膜蛋白，外联相邻细胞或基质，内联细胞骨架蛋白，整个细胞连接处于细胞内、外的不同部位，在深低温保存过程中这些部位所受到的损伤压力是不同的，如水与离子运动导致的渗透压变化、降温和复温过程中细胞体积变化造成的机械张力等，增加了细胞连接组成蛋白结构的变化、破坏和变性等。在低于-70℃的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时，其内部的生化反应可恢复正常。细胞冻存液是直接影响冻存后细胞活力、质量等的重要因素。冷冻速率直接决定这冷冻的效果，细胞在冷冻过程中存在如下变化：当细胞被冷冻至-5℃时，因冷冻液中添加冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍然没有结冰，当被冷冻至-5℃～-15℃时，细胞外出现结冰而细胞内并没有出现结冰状态，细胞内未结冰的水分子会比细胞外结冰的溶液中的水分子具有更高的化学能，其结果是，细胞内的水分子为了和细胞外的水分子化学能保持平衡，会向细胞外流动。冷冻速度不同，细胞内水分子向外流动的情况也不同，如果冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细胞内不会结冰；如果冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间流出，结果随着温度的降低，细胞内结冰，如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶非常小或者不结冰。现有常规的MDCK细胞冻存液有两种，一种是由DMSO(二甲基亚砜)、FBS(胎牛血清)和基础培养基配制而成，另一种是由DMSO与FBS按体积比1:9配制而成。这是目前较为普遍的细胞冻存方式，但是，采用上述冻存液进行冻存的操作，均是较为常规的方法进行的，使得冻存的MDCK细胞复苏后活率低，而且表面抗原丢失严重，影响实验效果。
因此，迫切需要出现一种能够效果保证冻存效果的方法，即能够有效避免细胞连接受损的一种保护细胞连接的深低温保存方法。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述问题，而提供了一种有效的MDCK细胞的冻存和复苏方法。本专利技术的MDCK细胞的冻存，它是按照以下步骤进行的：一、取传代培养至对数期的MDCK细胞，进行细胞消化培养后，离心，去上清，置于冰浴中，加入冻存液重悬细胞，至细胞密度达5×106/mL，得细胞冷冻液；其中，冻存液采用滴管沿冻存管壁滴加，滴加速度为：前3min按0.2mL/min的速度滴加，3～5min按0.5mL/min的速度滴加，剩余时间按0.75mL/min的速度滴加；二、先将冷冻管降至4℃，然后以1.5℃/min的速度降至-8℃，再取出放入-10℃，然后以1.0℃/min的速度降至-20℃，然后静置30min，再以0.5℃/min的速度降至-80℃，最后放入液氮保存；所述的冻存液由体积百分含量为10％的DMSO和体积百分含量为90％的胎牛血清组成。本专利技术的MDCK细胞的复苏，它是按照以下步骤进行的：一、将细胞生长液放入37℃水浴中预热，预热后用75％的酒精擦拭盛有细胞生长液的容器外壁，放入生物安全柜内；二、从液氮中取出权利要求1冻存的MDCK细胞，立即放入37℃水浴解冻，轻摇使其在1min内全部融化，然后以75％的酒精擦拭保存管外部，置于生物安全柜内；三、将融化后的MDCK细胞悬液，加入到预热至37℃的细胞生长液中，在1000rpm转速下离心5min，弃上清，再用预热至37℃的含20％胎牛血清细胞生长液重悬，即完成MDCK细胞的复苏。细胞复苏后将在2-3小时贴壁，为保证细胞复苏后良好快速的生长状态，此时更换含15％胎牛血清细胞生长液，37℃培养2-3小时，然后更换含10％胎牛血清细胞生长液。所述的EDTA-胰酶为质量百分含量为0.25％的EDTA-胰酶，其是由质量百分含量为0.25％的胰酶和0.53mMEDTA.4Na组成。本专利技术包含以下有益效果：本专利技术的冻存方法通过合理控制冷冻时的冻存速率，保持细胞内的水分不产生冰晶，并能够保证细胞处于冷冻状态，而且本申请通过在冻存前对细胞进行处理，对冻存液加入的速度进行限制，防止过度破坏细胞，如果加入快或者混合激烈，就会导致细胞损坏，导
致冻存过程中，细胞死亡。本专利技术的方法能够很好的保持MDCK细胞活力。本专利技术的复苏后的细胞活力达95％以上，保证了细胞质量，使其长期存活。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的MDCK细胞的冻存，它是按照以下步骤进行的：一、取传代培养至对数期的MDCK细胞，进行细胞消化培养后，离心，去上清，置于冰浴中，加入冻存液重悬细胞，至细胞密度达5×106/mL，得细胞冷冻液；其中，冻存液采用滴管沿冻存管壁滴加，滴加速度为：前3min按0.2mL/min的速度滴加，3～5min按0.5mL/min的速度滴加，剩余时间按0.75mL/min的速度滴加；二、先将冷冻管降至4℃，然后以1.5℃/min的速度降至-8℃，再取出放入-10℃，然后以1.0℃/min的速度降至-20℃，然后静置30min，再以0.5℃/min的速度降至-80℃，最后放入液氮保存；所述的冻存液由体积百分含量为10％的DMSO和体积百分含量为90％的胎牛血清组成。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：1×107/mL的细胞密度滴加10mL冻存液。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：在MDCK细胞冻存前，更换细胞培养液，再进行细胞消化培养。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：细胞消化过程如下：一、首先将EDTA-胰酶在37℃温度下预热，向传代培养至对数期的MDCK细胞中加入2ML的EDTA-胰酶，置于灭菌细胞瓶内，使EDTA-胰酶均匀分布在MDCK细胞薄层，37℃1min，然后去除EDTA-胰酶；二、重新加入2mL预热至37℃的EDTA-胰酶，重复上述步骤；三、加入1mLEDTA-胰酶，摇匀，置于37℃孵育3-5min，摇动细胞瓶至细胞成悬液，然后加入1mL胎牛血清中和；四、加入8mL细胞生长液，用移液管从细胞瓶底部的一边向另一边进行吹打，且避免泡沫产生；五、吹打后再加入细胞生长液至细胞悬液浓度为1×106/mL细胞，即完成。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：传代培养至对数期的
MDCK细胞是采用含10％胎牛血清的DMEM/F12基础培养基进行培养的。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式六：本实施方式的MDCK细胞的复苏，它是按照以下步骤进行的：一、将细胞生长液放入37℃水浴中预热，预热后用75％的酒精擦拭盛有细胞生长液的容器外壁本文档来自技高网...
【技术保护点】
MDCK细胞的冻存，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、取传代培养至对数期的MDCK细胞，进行细胞消化培养后，离心，去上清，置于冰浴中，加入冻存液重悬细胞，至细胞密度达5×106/mL，得细胞冷冻液；其中，冻存液采用滴管沿冻存管壁滴加，滴加速度为：前3min按0.2mL/min的速度滴加，3～5min按0.5mL/min的速度滴加，剩余时间按0.75mL/min的速度滴加；二、在步骤一处理后，先将冷冻管降至4℃，然后以1.5℃/min的速度降至‑8℃，再取出放入‑10℃，然后以1.0℃/min的速度降至‑20℃，然后静置30min，再以0.5℃/min的速度降至‑80℃，最后放入液氮保存；所述的冻存液由体积百分含量为10％的DMSO和体积百分含量为90％的胎牛血清组成。
【技术特征摘要】
1.MDCK细胞的冻存，其特征在于它是按照以下步骤进行的：一、取传代培养至对数期的MDCK细胞，进行细胞消化培养后，离心，去上清，置于冰浴中，加入冻存液重悬细胞，至细胞密度达5×106/mL，得细胞冷冻液；其中，冻存液采用滴管沿冻存管壁滴加，滴加速度为：前3min按0.2mL/min的速度滴加，3～5min按0.5mL/min的速度滴加，剩余时间按0.75mL/min的速度滴加；二、在步骤一处理后，先将冷冻管降至4℃，然后以1.5℃/min的速度降至-8℃，再取出放入-10℃，然后以1.0℃/min的速度降至-20℃，然后静置30min，再以0.5℃/min的速度降至-80℃，最后放入液氮保存；所述的冻存液由体积百分含量为10％的DMSO和体积百分含量为90％的胎牛血清组成。2.根据权利要求1所述的MDCK细胞的冻存，其特征在于1×107/mL的细胞密度滴加10mL冻存液。3.根据权利要求1所述的MDCK细胞的冻存，其特征在于在MDCK细胞冻存前，更换细胞培养液，再进行细胞消化培养。4.根据权利要求1所述的MDCK细胞的冻存，其特征在于细胞消化过程如下：一、首先将EDTA-胰酶在37℃温度下预热，向传代培养至对数期的MDCK细胞中加入2ML的EDTA-胰酶，置于灭菌细胞瓶内，使EDTA-胰酶均匀分布在MDCK细胞薄层，37℃1min，然后去除...
【专利技术属性】
技术研发人员：张崇华，任莉娜，魏丽娜，
申请(专利权)人：哈尔滨市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。