本发明专利技术涉及胎盘全细胞分离、冻存和复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法，其包括如下步骤：对胎盘组织进行消毒和清洗；从组织剪下胎盘小叶，消化处理20分钟；配制胎盘组织冻存液备用；将消化处理得到的全细胞和冻存液加入冻存管中，在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80℃的温度条件下冷冻1天，然后液氮中冷冻备用；需要时将胎盘全细胞从液氮中取出，恒温水浴解冻，利用间充质干细胞培养基进行点滴法清洗，利用红细胞裂解液清除红细胞，复苏的胎盘全细胞可通过细胞培养和细胞传代扩增间充质干细胞。本发明专利技术方法可有效保护冻存胎盘组织，且方便复苏使用，尤其适合复苏后分离和扩增间充质干细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对胎盘全细胞进行处理的方法，具体涉及对胎盘全细胞冻存、复苏处理，以及由复苏后的胎盘全细胞分离和扩增干细胞的方法，特别涉及对胎盘全细胞进行冻存、复苏，然后再从中分离和扩增间充质干细胞的方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、免疫调节和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。 MSC在骨髓中蕴含丰富，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髓MSC的临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。近期的研究显示，胎盘组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因足以令胎盘间充质干细胞成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。但是，胎盘组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，而且每一份胎盘组织的处理和分离后的细胞培养都需要一定的时间和人员的消耗。因此将胎盘组织冻存并且在有需要的时候复苏进行干细胞分离的做法相对更符合成本效益。因此，本领域需要一个简单和高效的胎盘组织冻存、复苏和间充质干细胞的分离和扩增的方法，以满足医药、科研、临床等领域的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术冻存、复苏胎盘全细胞方法的缺陷，提供一种简单有效的胎盘全细胞冻存的方法，以及相配套使用的冻存胎盘全细胞复苏的方法，以及复苏后间充质干细胞扩增的方法。本专利技术发现对胎盘全细胞使用特定操作步骤的冻存、复苏以及分离和扩增，可简单、有效地从胎盘组织例如胎盘全细胞分离原代间充质干细胞，并且可以对原代间充质干细胞在冻存过程中有效地进行保护。本专利技术基于此发现而得以完成。因此，本专利技术第一方面提供了处理胎盘全细胞的方法，该方法包括以下对胎盘离体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤(I)胎盘组织清洗通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗胎盘组织，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；(2)胎盘组织消化处理从步骤(I)得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，加入缓冲液(例如PBS缓冲液)并将小叶剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化处理5-40分钟(例如10-30分钟，例如约20分钟)；(3)胎盘组织过滤处理加入FBS溶液(Gibco)终止消化，将消化处理后的胎盘组织碎片转移至过滤装置，对胎盘组织碎片进行研磨，同时收集滤液，对滤液进行细胞清洗；(4)配制胎盘全细胞冻存液所述胎盘全细胞冻存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亚砜)和DMEM-F12，配好的冻存液放在1°C至7 V (例如约4°C )的温度条件下低温冷藏；(5)胎盘全细胞冻存将步骤⑶得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在0-15°C (例如1°C至TC，例如约4°C )的低温环境下，加入步骤⑷得到的全细胞冻存液，·然后转移至冻存容器中，冻存容器放入程序降温装置，先在1°C至TC (例如4°C)的温度条件下低温冷藏O. 2-2小时(例如约O. 5小时)，再在-10°C至_150°C (例如约_80°C )的温度条件下冷冻O. 25-3天(例如约I天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用。根据本专利技术第一方面的方法，该方法还包括以下对冻存的胎盘离体新鲜组织全细胞进行复苏的步骤(6)冻存胎盘全细胞复苏将步骤(5)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出，解冻至20%-70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗细胞，离心处理清洗DMS0，去除上清液，进行红细胞裂解步骤，离心处理后去除上清液，观察红细胞裂解情况，如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解，最后进行细胞清洗步骤，去除上清液。根据本专利技术第一方面的方法，该方法还包括以下对复苏的胎盘全细胞进行间充质干细胞分离和扩增的步骤(7)细胞培养向步骤(6)得到的全细胞中补加适量的间充质干细胞培养基重悬细胞，接种至培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第4-7天(例如第5天，例如第6天，例如第7天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次半换液，继续培养，在第8-10天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第二次半换液，继续培养，在第11-13天(例如第12天)时将培养容器从培养箱中取出，加入5-20ml (例如10-18ml，例如15ml)间充质干细胞培养基，往后每1-4天(例如2-3天)进行一次全换液；(8)细胞传代当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%_90%(例如80%)以后，利用消化酶(例如TrypLe Express)将贴壁细胞脱离容器底部,离心,抽走上清液,加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%(例如80%)后，即得胎盘间充质干细胞，必要时进行传代；以及任选的下列一个或多个步骤(9)对针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(10)将步骤⑶所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冷冻，备用。根据本专利技术第一方面的方法，该方法包括(A)以下对胎盘离体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤(I)胎盘组织清洗通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗胎盘组织，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；(2)胎盘组织消化处理从步骤⑴得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，加入缓冲液(例如PBS缓冲液)并将小叶剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化处理5-40分钟(例如10-30分钟，例如20分钟)；(3)胎盘组织过滤处理加入FBS溶液终止消化，将消化处理后的胎盘组织碎片转移至过滤装置，对胎盘组织碎片进行研磨，同时收集滤液，对滤液进行细胞清洗；(4)配制胎盘全细胞冻存液所述胎盘全细胞冻存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亚砜)和DMEM-F12，配好的冻存液放在1°C至7°C (例如4°C )的温度条件下低温冷藏； (5)胎盘全细胞冻存将步骤(3)得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在0-15°C (例如1°C至TC，例如4°C )的低温环境下，加入步骤(4)得到的全细胞冻存液，然后转移至冻存容器中，冻存容器放入程序降温装置，先在1°C至TC (例如4°C)的温度条件下低温冷藏O. 2-2小时(例如O. 5小时)，再在-10°C至_150°C (例如_80°C )的温度条件下冷冻O. 25-3天(例如I天)，然后将冻存本文档来自技高网...
【技术保护点】
处理胎盘全细胞的方法，该方法包括：(A)以下对胎盘离体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤：(1)胎盘组织清洗：通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗胎盘组织，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；(2)胎盘组织消化处理：从步骤(1)得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，加入缓冲液(例如PBS缓冲液)并将小叶剪碎，加入消化酶溶液(例如其非限制性地包含胰酶)中，消化处理5？40分钟(例如20分钟)；(3)胎盘组织过滤处理：加入FBS(Gibco)溶液终止消化，将消化处理后的胎盘组织碎片转移至过滤装置，对胎盘组织碎片进行研磨，同时收集滤液，对滤液进行细胞清洗；(4)配制胎盘全细胞冻存液：所述胎盘全细胞冻存液中包含人血白蛋白、DMSO(二甲基亚砜)和DMEM？F12，配好的冻存液放在1℃至7℃(例如4℃)的温度条件下低温冷藏；(5)胎盘全细胞冻存：将步骤(3)得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在0？15℃(例如1℃至7℃，例如4℃)的低温环境下，加入步骤(4)得到的全细胞冻存液，然后转移至冻存容器中，冻存容器放入程序降温装置，先在1℃至7℃(例如4℃)的温度条件下低温冷藏0.2？2小时(例如0.5小时)，再在？10℃至？150℃(例如？80℃)的温度条件下冷冻0.25？3天(例如1天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用；任选地，进一步进行(B)以下对冻存的胎盘离体新鲜组织全细胞进行复苏的步骤：(6)冻存胎盘全细胞复苏：将步骤(5)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出，解冻至20%？70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗细胞，离心处理清洗DMSO，去除上清液，进行红细胞裂解步骤，离心处理后去除上清液，观察红细胞裂解情况，如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解，最后进行细胞清洗步骤，去除上清液；任选地，进一步进行(C)以下对复苏的胎盘全细胞进行间充质干细胞 分离和扩增的步骤：(7)细胞培养：向步骤(6)得到的全细胞中补加适量的间充质干细胞培养基重悬细胞，接种至培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第4？7天(例如第5天，例如第6天，例如第7天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次半换液，继续培养，在第8？10天(例如第9天)时将培养容器从培养箱中取出，进行第二次半换液，继续培养，在第11？13天(例如第12天)时将培养容器从培养箱中取出，加入5？20ml(例如10？18ml，例如15ml)间充质干细胞培养基，往后每1？4天(例如2？3天)进行一次全换液；(8)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%？90%(例如80%)以后，利用消化酶(例如TrypLe？Express)将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1？3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70？90%(例如80%)后，即得胎盘间充质干细胞，必要时进行传代；以及任选的下列一个或多个步骤：(9)对针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA？ABC/DR配型；(10)将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冷冻，备用。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林卓衡，朱业峰，陈俊峯，周丹，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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