外周血浓缩细胞和浓缩上清组合剂治疗卵巢早衰的用途制造技术

本发明专利技术涉及外周血浓缩细胞和浓缩上清组合剂治疗卵巢早衰的用途。一方面，所述组合剂包含外周血浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子、上清浓缩液和任选的赋形剂；所述外周血浓缩细胞和上清浓缩液是使用细胞自动分离系统和切向流超滤系统制得的。所述浓缩细胞的比例为，浓缩细胞以CD45

【技术实现步骤摘要】
外周血浓缩细胞和浓缩上清组合剂治疗卵巢早衰的用途


[0001]本专利技术属于生物技术和生物医药领域，涉及使用细胞治疗剂治疗卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)的方法。具体地说，本专利技术首先涉及从动员外周血(Mobilized Peripheral Blood，MPB，亦可简称为外周血)中快速分离制备动员外周血浓缩细胞的细胞治疗剂，接着将其与GM
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CSF(粒细胞巨噬细胞刺激因子，亦称为粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，Granulocyte/Macrophage Colony
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stimulating Factor，gmCSF)配制成细胞治疗剂的组合物，进而使用此种动员外周血浓缩细胞组合物治疗早发性卵巢功能不全和卵巢早衰的方法。使用本专利技术方法可以有效的提高从动员外周血中分离动员外周血浓缩细胞的效率，提供一种安全、高效、简捷获得动员外周血浓缩细胞用于治疗卵巢早衰和卵巢功能不全例如早发性卵巢功能不全的方法。本专利技术还通过使所制得的外周血浓缩细胞、上清浓缩液与GM
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CSF组合为治疗卵巢早衰提供了一个新的有效途径。

技术介绍

[0002]卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)，是指由于卵巢功能衰竭，导致女性40岁之前闭经、不孕的现象。POF是一种以闭经、不孕、雌激素缺乏、卵泡减少和促性腺激素增高为特征的疾病，并伴有一系列低雌激素症状如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下等，严重影响女性的身心健康。此外，POF的女性，患骨质疏松症、心血管疾病和老年痴呆的风险增加。POF是导致女性不孕的重要原因之一。育龄女性POF的发病率约1
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3％，且呈上升和年轻化趋势。
[0003]根据欧洲人类生殖与胚胎学学会的指南(ESHRE)，POF的诊断标准：少经或闭经至少4个月，间隔4周以上的两次FSH水平升高>40IU/L。卵巢早衰病因不明，可能与遗传和自身免疫性疾病、环境因素以及医源性和特发性情况有关，尚无有效的治疗方法。激素替代疗法(HRT)是POF最常见的治疗方法之一，但效果并不理想，而且已被证明会增加静脉血栓、乳腺癌和卵巢癌的风险。POF除了少经、闭经、不孕等症状，还可出现潮热、多汗、焦虑、抑郁、心悸、失眠等更年期症状，可能加快女性衰老，导致骨质疏松、心血管疾病、痴呆症等绝经后疾病，影响女性生活质量和寿命。
[0004]POF病因复杂，尚未完全阐明，可能与自身免疫应答、感染、遗传因素、化疗、放疗、手术等治疗效果及内分泌功能障碍有关，尚无有效的治疗方法。目前，POF的最常用的治疗方法是激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)。该疗法虽然对POF的临床症状具有一定的缓解作用，然而，HRT不能从根本上修复受损的卵巢，恢复卵巢功能。此外，研究表明，长期HRT治疗增加心脏病和中风的风险，可能会增加乳腺癌和卵巢癌的风险。因此，需要新的治疗策略来恢复POF患者的卵巢功能。
[0005]造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)是一种可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板的细胞亚群。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群，MSCs通过旁分泌多种生长因子，对HSCs起到支持的作用，维持骨髓造血微环境的稳定。目前，骨髓移植
成为治疗血液疾病的有效手段，但是骨髓移植由于费用高，来源缺乏等诸多因素限制，逐渐由外周血造血干细胞移植替代，外周血造血干细胞(PBSC)通过集落刺激因子的动员，使PBSC变得更易采集，利用PBSC的造血和提高免疫力的功能，来治疗急、慢性白血病、多发性骨髓瘤等血液肿瘤疾病。
[0006]正常外周血中，外周血造血干细胞(PBSC)含量很少，通过集落刺激因子，把骨髓中的干细胞动员到外周血中，以便更好的采集PBSCs，是动员外周血的一种方式。外周血造血干细胞动员是外周血造血干细胞移植(PBSCT)中的重要环节，直接影响PBSCT的疗效。目前在临床上干细胞动员的方案有三种，即大剂量化疗、单用造血生长因子(HGF)和二者联合。
[0007]正常情况下，PBSC数目很少，只占有形核细胞的0.1％左右，尽管形态上无法鉴别PBSC，但是可以根据它们的免疫表型来区别。一般认为PBSC包括外周血中的CD34+细胞等。通过集落刺激因子动员后，一般第4～6天外周血干细胞出现高峰，此时通过外周静脉单采术获得PBSC，干细胞和粒细胞在离心后与红细胞和血浆成分分离，红细胞和血浆回输给供者。
[0008]动员外周血浓缩细胞是将动员外周血经过离心、分离后获得的有核细胞的浓缩物。此类浓缩细胞中包含富集的造血干细胞(HSCs)和间充质干细胞(MSCs)，以及大量的多种细胞生长因子。HSCs可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板。MSCs是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。动员外周血浓缩细胞中含有血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF
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β)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子I(IGF
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I)、骨形态发生蛋白(BMP
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2、BMP
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7)和白细胞介素(IL
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1，IL
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6，IL
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8)等多种生长因子和细胞因子。
[0009]动员外周血浓缩细胞具有抗炎、免疫调节特性、促血管生成、促进组织再生修复等作用。临床前和初步临床研究证实，动员外周血浓缩细胞通过改善卵巢微环境，促进血管生成，促进卵泡发育，增加窦状卵泡数量，促进排卵，从而改善卵巢功能，是治疗POF患者潜在的治疗方法。
[0010]然而，动员外周血在传统上采用手工操作方式以密度梯度离心法进行分离，存在操作复杂、耗时长、易污染、结果重复性差等非常棘手的问题。本领域技术人员期待有一种操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好等一个或者多个方面有益效果的处理动员外周血以获得动员外周血浓缩物即动员外周血浓缩细胞的方法。此一技术进步已在本研究团队的中国专利申请号2021116067853中得以实现。
[0011]粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM
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CSF)主要由T细胞和巨噬细胞产生，能够诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体细胞呈集落生长，故简称为粒
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巨细胞集落刺激因子。GM
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CSF在体内的主要生物学作用是维持粒细胞系和单核细胞系细胞的存活、促进生长、诱导分化和增强吞噬功能和杀菌作用；诱导树突状细胞成熟和功能分布。临床上使用的粒细胞巨噬细胞刺激因子通常为重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，其通常适用于癌症化疗和在用骨髓抑制疗法时所引起的白细胞减少症，亦适用于治疗骨髓衰竭患者的白细胞低下，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.外周血浓缩细胞和浓缩上清组合剂或者该组合剂治疗卵巢早衰的用途，所述组合剂包含外周血浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子、上清浓缩液、谷氨酰胺、亚硒酸钠、和任选的赋形剂；所述外周血浓缩细胞和上清浓缩液是按照包括如下步骤的方法制备得到的：(1)提供生物样本外周血例如动员外周血浓缩细胞，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；(2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离系统是封闭式的PXP分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理系统；(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：(4)启动离心机进行离心，进程如下：4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的外周血例如动员外周血浓缩细胞；(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理系统处理离心过程中所捕获的数据；(7)用注射器分取中央舱室内的上清液(即血浆层)，2000g离心20min除去细胞碎片，再经0.22μm无菌滤膜过滤；(8)用超纯水冲洗切向流超滤系统(仕必纯KR2i型切向流超滤系统)的管路，安装100kD 100cm2的MidiKros过滤器，对步骤(7)所得滤液超滤浓缩至初始生物样本量的1/15体积，得到上清浓缩液。2.根据权利要求1的组合剂或用途，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20～200ml。3.根据权利要求1的组合剂或用途，其中：步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液；步骤(1)所用抗凝剂为3.5％枸橼酸钠溶液；步骤(1)所用抗凝剂为3.5％枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.12mg/ml磷脂酰胆碱；步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12；步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60℃搅拌使溶解，加水至全量，0.22μm微孔滤膜过滤，121℃热压灭菌，即得。4.根据权利要求1的组合剂或用途，...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖海蓉，刘冰，徐勇，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：