【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种细胞的制备方法，尤其涉及一种i型nkt细胞又称为inkt细胞的制备方法。进一步的，本专利技术还涉及一种i型nkt细胞。本专利技术的方法可以快速大量地扩增高纯度i型nkt细胞。
技术介绍
1、nkt细胞是一种特殊的t淋巴细胞亚群，其表面既有t细胞受体，又有nk细胞受体。nkt细胞在肿瘤、自身免疫性疾病和微生物感染中起到调节免疫应答的作用，是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁。
2、nkt细胞根据其t细胞受体(t cell receptor，tcr)表达类型、对糖脂类抗原的反应及发育过程中是否具有cd1d依赖性，分为3种类型：i型、ii型和iii型nkt细胞。
3、i型nkt细胞又称为inkt细胞(invariant nkt)，表达恒定的tcrα链，同时共表达vβ链，并同时能被cd1d分子所提呈的α-半乳糖神经酰胺(α-galactosylceramide，α-galcer)激活。
4、inkt细胞在机体内能发挥重要的免疫调节作用，参与抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病的免疫反应。由于人体外周血中inkt细胞含量低(约占淋巴细胞的0.01~1％)，目前扩增方法存在起始细胞需求量大、扩增周期长、细胞制剂纯度低、活性弱等技术难题，最终导致临床整体缓解率低，抗肿瘤效果不理想。
5、因此，本领域技术人员迫切期待提供一种能够快速大量地扩增高纯度i型nkt细胞的方法，亦迫切期待提供一种具有优良生物学活性的i型nkt细胞。
技术实现思路>
1、本专利技术的目的在于提供一种能够快速大量地扩增高纯度i型nkt细胞的方法，或者本专利技术的目的在于提供一种具有优良生物学活性的i型nkt细胞。本专利技术人发现，通过使用脐带血制备i型nkt细胞，能够获得一个或者多个方面的优良效果，本专利技术基于此类发现而得以完成。
2、为此，本专利技术第一方面提供了一种制备i型nkt细胞的方法，包括如下步骤：
3、1)分离单个核细胞：取单个核细胞来源组织转移到axp®单个核细胞分离系统(axp®，thermogenesis)的配套处理耗材内，装入axp®单个核细胞分离系统，放入离心机，以离心力(rcf)1500g离心20min，再以离心力120g离心10min后取出，自动分离得到单个核细胞，导出axp®数据，得到单个核细胞的分离数量；
4、2)磁珠法分选cd34+细胞：将步骤1)得到的单个核细胞使用pbs重悬(例如至浓度2×108细胞/ml)，根据rosetteseptm人造血祖细胞预富集试剂盒说明书操作法加入50µl/mlrosettesep人造血祖细胞富集抗体，室温(15℃-25℃)孵育20分钟，按照1：1比例加入pbs清洗，以离心力100g离心10min，去上清，得到富集造血祖细胞，用pbs重悬至浓度1×108细胞/ml；然后根据easyseptm人全血cd34+分选试剂盒说明书操作法加入人cd34正选抗体混合物(抗体混合物：细胞的比为1ml：20~30ml)细胞，正选得到cd34+细胞，用完全培养基重悬，待用；
5、3)诱导分化inkt细胞：将分离得到的cd34+细胞与间充质干细胞以(40~60)：1细胞数比例在完全培养基中(例如cd34+细胞的浓度为1×106/ml)以37℃、5%co2共培养7-9天，每隔2天半量更换完全培养基，诱导分化得到inkt细胞；
6、4)扩增inkt细胞：将诱导分化得到的inkt细胞使用nk增补培养基进行扩增培养，间隔2天半量换液，以37℃、5%co2培养至第7~9天，得到大量的inkt细胞，以离心力100g离心10min，去上清，使用生理盐水或平衡盐液重悬，再次以离心力100g离心10min，去上清，得到inkt细胞；任选地用生理盐水或平衡盐液重悬；例如，所述生理盐水是氯化钠注射液例如浓度为0.9%的氯化钠注射液，所述平衡盐液是乳酸钠林格注射液。
7、根据本专利技术第一方面的方法，所述单个核细胞来源组织为脐带血。
8、根据本专利技术第一方面的方法，所述完全培养基组成为：甘氨酸18.75mg/l、l-丙氨酸4.45mg/l、l-盐酸精氨酸147.5mg/l、l-天冬氨酸7.5mg/l、l-天门冬氨酸6.65mg/l、l-盐酸半胱氨酸17.56mg/l、l-盐酸胱氨酸31.29mg/l、l-谷氨酸7.35mg/l、l-谷氨酰胺365.0mg/l、l-盐酸组氨酸31.48mg/l、异亮氨酸54.47mg/l、l-亮氨酸59.05mg/l、l-赖氨酸盐酸盐91.25mg/l、l-蛋氨酸17.24mg/l、l-苯丙氨酸35.48mg/l、脯氨酸17.25mg/l、l-丝氨酸26.25mg/l、l-苏氨酸53.45mg/l、l-色氨酸9.02mg/l、l-酪氨酸二钠二水合物55.79mg/l、l-缬氨酸52.85mg/l、生物素0.0035mg/l、氯化胆碱8.98mg/l、d-泛酸钙2.24mg/l、叶酸2.65mg/l、烟酰胺2.02mg/l、盐酸吡多辛2.013mg/l、核黄素0.219mg/l、盐酸硫胺素2.17mg/l、b12维生素0.68mg/l、肌醇12.6mg/l、无水氯化钙116.6mg/l、五水硫酸铜0.0013mg/l、九水硝酸铁0.05mg/l、七水硫酸亚铁0.417mg/l、无水氯化镁28.64mg/l、无水硫酸镁48.84mg/l、氯化钾311.8mg/l、碳酸氢钠2438.0mg/l、氯化钠6995.5mg/l、磷酸氢二钠无水物71.02mg/l、磷酸二氢钠一水合物62.5mg/l、七水硫酸锌0.432mg/l、葡萄糖3151.0mg/l、次黄嘌呤钠2.39mg/l、亚油酸0.042mg/l、硫辛酸0.105mg/l、酚红8.1mg/l、盐酸腐胺0.081mg/l、丙酮酸钠55.0mg/l、胸腺嘧啶0.365mg/l、2%血小板裂解物、10µg/l的scf、20µg/l的flt3、10µg/l的il-3、20µg/l的gm-csf、10µg/l的il-7。
9、根据本专利技术第一方面的方法，所述pbs是按照如下方法配制的ph6.8的磷酸盐缓冲液：取0.2mol/l磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/l氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
10、根据本专利技术第一方面的方法，所述nk增补培养基组成为：l-精氨酸290mg/l、l-门冬酰胺50mg/l、l-门冬氨酸20mg/l、l-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/l、l-谷氨酸20mg/l、甘氨酸10mg/l、l-组氨酸15mg/l、l-羟脯氨酸20mg/l、l-异亮氨酸50mg/l、l-亮氨酸50mg/l、l-赖氨酸盐酸盐40mg/l、l-甲硫氨酸15mg/l、l-苯丙氨酸15mg/l、l-脯氨酸20mg/l、l-丝氨酸30mg/l、l-苏氨酸20mg/l、l-色氨酸5mg/l、l-酪氨酸23.19mg/l、l-缬氨酸20mg/l、对氨基苯甲酸1mg/l、硝酸钙100mg/l、无水硫酸镁48.8本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.制备I型NKT细胞的方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1的方法，所述单个核细胞来源组织为脐带血。
3.根据权利要求1的方法，所述单个核细胞的浓度为1×106/mL；和/或，所述完全培养基组成为：甘氨酸18.75mg/L、L-丙氨酸4.45mg/L、L-盐酸精氨酸147.5mg/L、L-天冬氨酸7.5mg/L、L-天门冬氨酸6.65mg/L、L-盐酸半胱氨酸17.56mg/L、L-盐酸胱氨酸31.29mg/L、L-谷氨酸7.35mg/L、L-谷氨酰胺365.0mg/L、L-盐酸组氨酸31.48mg/L、异亮氨酸54.47mg/L、L-亮氨酸59.05mg/L、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg/L、L-蛋氨酸17.24mg/L、L-苯丙氨酸35.48mg/L、脯氨酸17.25mg/L、L-丝氨酸26.25mg/L、L-苏氨酸53.45mg/L、L-色氨酸9.02mg/L、L-酪氨酸二钠二水合物55.79mg/L、L-缬氨酸52.85mg/L、生物素0.0035mg/L、氯化胆碱8.98mg/L、D-泛酸钙2.24mg/L、叶酸2.65mg/L、烟酰胺2.
4.根据权利要求1的方法，所述PBS是按照如下方法配制的pH6.8的磷酸盐缓冲液：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
5.根据权利要求1的方法，所述NK增补培养基组成为：L-精氨酸290mg/L、L-门冬酰胺50mg/L、L-门冬氨酸20mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/L、L-谷氨酸20mg/L、甘氨酸10mg/L、L-组氨酸15mg/L、L-羟脯氨酸20mg/L、L-异亮氨酸50mg/L、L-亮氨酸50mg/L、L-赖氨酸盐酸盐40mg/L、L-甲硫氨酸15mg/L、L-苯丙氨酸15mg/L、L-脯氨酸20mg/L、L-丝氨酸30mg/L、L-苏氨酸20mg/L、L-色氨酸5mg/L、L-酪氨酸23.19mg/L、L-缬氨酸20mg/L、对氨基苯甲酸1mg/L、硝酸钙100mg/L、无水硫酸镁48.84mg/L、无水磷酸二氢钠676.13mg/L、氯化钾400mg/L、氯化钠6000mg/L、葡萄糖2000mg/L、还原谷胱甘肽1mg/L、酚红5mg/L、L-谷氨酰胺300mg/L、生物素0.20mg/L、D-泛酸钙0.25mg/L、叶酸1mg/L、i-肌醇35mg/L、烟酰胺1mg/L、氯化胆碱3mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、核黄素0.20mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、0.005mg/L维生素B12、碳酸氢钠2000mg/L、反-4-氨甲基环己烷甲酸45mg/L、奥曲肽5mg/L、20µg/L的IL-15、20µg/L的GM-CSF、1000U/ml的IL-2、20µg/L的IL-21、5µg/L的α-半乳糖神经酰胺。
6.根据权利要求1的方法，所述脐带血间充质干细胞是按照包括如下步骤的方法培养得到的：
7.根据权利要求6的方法，其中脐带血MSC培养基1组分为：IMDM基础培养基(GIBCO)、体积浓度为10%的脐带血血浆、15ng/ml的GM-CSF、体积浓度2% HEPES、体积浓度1%青-链霉素、体积浓度1%L-谷氨酰胺；和/或，脐带血MSC培养基2组分为：IMDM基础培养基(GIBCO)、体积浓度为10%的脐带血血浆、10ng/ml的IL-1β、体积浓度2% HEPES、体积浓度1%青链霉素、体积浓度1%L-谷氨酰胺。
8.一种脐带血来源的iNKT细胞，其是通过权利要求1~7任一项所述方法制备得到的。
9.用...
【技术特征摘要】
1.制备i型nkt细胞的方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1的方法，所述单个核细胞来源组织为脐带血。
3.根据权利要求1的方法，所述单个核细胞的浓度为1×106/ml；和/或，所述完全培养基组成为：甘氨酸18.75mg/l、l-丙氨酸4.45mg/l、l-盐酸精氨酸147.5mg/l、l-天冬氨酸7.5mg/l、l-天门冬氨酸6.65mg/l、l-盐酸半胱氨酸17.56mg/l、l-盐酸胱氨酸31.29mg/l、l-谷氨酸7.35mg/l、l-谷氨酰胺365.0mg/l、l-盐酸组氨酸31.48mg/l、异亮氨酸54.47mg/l、l-亮氨酸59.05mg/l、l-赖氨酸盐酸盐91.25mg/l、l-蛋氨酸17.24mg/l、l-苯丙氨酸35.48mg/l、脯氨酸17.25mg/l、l-丝氨酸26.25mg/l、l-苏氨酸53.45mg/l、l-色氨酸9.02mg/l、l-酪氨酸二钠二水合物55.79mg/l、l-缬氨酸52.85mg/l、生物素0.0035mg/l、氯化胆碱8.98mg/l、d-泛酸钙2.24mg/l、叶酸2.65mg/l、烟酰胺2.02mg/l、盐酸吡多辛2.013mg/l、核黄素0.219mg/l、盐酸硫胺素2.17mg/l、b12维生素0.68mg/l、肌醇12.6mg/l、无水氯化钙116.6mg/l、五水硫酸铜0.0013mg/l、九水硝酸铁0.05mg/l、七水硫酸亚铁0.417mg/l、无水氯化镁28.64mg/l、无水硫酸镁48.84mg/l、氯化钾311.8mg/l、碳酸氢钠2438.0mg/l、氯化钠6995.5mg/l、磷酸氢二钠无水物71.02mg/l、磷酸二氢钠一水合物62.5mg/l、七水硫酸锌0.432mg/l、葡萄糖3151.0mg/l、次黄嘌呤钠2.39mg/l、亚油酸0.042mg/l、硫辛酸0.105mg/l、酚红8.1mg/l、盐酸腐胺0.081mg/l、丙酮酸钠55.0mg/l、胸腺嘧啶0.365mg/l、2%血小板裂解物、10µg/l的scf、20µg/l的flt3、10µg/l的il-3、20µg/l的gm-csf、10µg/l的il-7。
4.根据权利要求1的方法，所述pbs是按照如下方法配制的ph6.8的磷酸盐缓冲液：取0.2mol/l磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/l氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
5.根据权利要求1的方法，所述nk增补培养基组成为：l-精氨酸290mg/l、l-门冬酰胺50mg/l、l-门冬氨酸20mg/l、l-胱氨酸二盐酸盐65.15mg/l、l-谷氨酸20mg/l、甘氨酸10mg/l、l-组氨酸15mg/l、l-羟脯氨酸20mg/l、l-异亮氨酸50mg/l、l-亮氨酸50mg/l、l-赖氨酸盐酸盐40mg/l、l-甲硫氨酸15mg/l、l-苯丙氨酸15mg/l、l-脯氨酸20mg/l、l-丝氨酸30mg/l、l-苏氨酸20mg/l、l-色氨酸5mg/l、l-酪氨酸23.19mg/l、l-缬氨酸20mg/l、对氨基苯甲酸1mg/l、硝酸钙100mg/l、无水硫酸镁48.84mg/l、无水磷酸二氢钠676.13mg/l、氯化钾400mg/l、氯化钠6000mg/l、葡萄糖2000mg/l、还原谷胱甘肽1mg/l、酚红5mg/l、l-谷氨酰胺300mg/l、生物素0.20mg/l、d-泛酸钙0.25mg/l、叶酸1mg/l、i-肌醇35mg/l、烟酰胺1mg/l、氯化胆碱3mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l、核黄素0.20mg/l、盐酸硫胺素1mg/l、0.005mg/l维生素b12、碳酸氢钠2000mg/l、反-4-氨甲基环己烷甲酸45mg/l、奥曲肽5mg/l、20µg/l的il-15、20µg/l的gm-csf、1000u/ml的il-2、20µg/l的il-21、5µg/l的α-半乳糖神经酰胺。
6.根据权利要求1的方法，所述脐带血间充质干细胞是按照包括如下步骤的方法培养得到的：
7.根据权利要求6的方法，其中...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆伟峰，刘冰，王正，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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