【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法。
技术介绍
1、巨噬细胞是机体固有免疫系统的重要成员，通过吞噬杀菌、参与炎症反应、加工提呈抗原和免疫调节等多种功能参与机体的免疫应答。组织巨噬细胞具有高度的异质性，可协同其他细胞共同维护组织稳态。其中，心脏巨噬细胞作为心脏组织最为丰富的免疫细胞，可调节心脏淋巴管和血管的生成，及时清除心肌组织受损的线粒体和凋亡细胞等以维持心脏内环境稳态，并可通过连接蛋白43结合房室结细胞促进心脏电传导等。随着心脏巨噬细胞在心脏发生、发育、生理活动等过程中的重要作用被揭示，关于心脏巨噬细胞表型及功能的研究已成为心血管疾病研究的重点与热点。其中，关于心脏巨噬细胞的异质性功能研究可较为直接的解释其在心血管系统中的作用。因此，应用于心脏巨噬细胞的研究方法被广泛开发，其中包括：利用流式细胞术、免疫荧光等鉴定心脏巨噬细胞不同亚群；利用巨噬细胞系或原代骨髓来源巨噬细胞进行功能探究。然而巨噬细胞系或原代骨髓来源巨噬细胞无法全面模拟心脏巨噬细胞的独特功能，因此，心脏巨噬细胞的分离和体外培养成为了目前研究心脏巨噬细胞功能异质性的必要手段。目前广泛应用的组织巨噬细胞的分离方法为磁珠分离法和流式细胞术分选法，然而直接应用上述方法获得心脏巨噬细胞存在细胞获得率低、细胞活性减弱等问题，因此，针对现有技术所存在心脏巨噬细胞获得率低的问题，本专利技术专利利用含巨噬细胞集落刺激因子的dulbecco改良eagle培养基（dulbecco's modifiedeagle medium，dmem）连续培养5天，去除非
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术存在心脏巨噬细胞活性降低的问题，实现了心脏巨噬细胞的体外长期培养和分离，并且在体外保持较高的活性，利用添加转化生长因子β和低浓度葡萄糖的培养基，对流式分选所获得的心脏巨噬细胞进行体外培养，以维持其体外活性。心脏巨噬细胞的功能探究对于心血管疾病的发病机制的阐明具有重要意义，可利用该方法检测心脏巨噬细胞细胞在生理条件下和疾病状态下细胞因子分泌等功能，以期深入探究心脏巨噬细胞的独特功能。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是；
3、一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4、正常小鼠心脏组织单细胞悬液制备完成后，进行细胞计数；
5、取一定细胞密度接种于细胞培养板中；
6、细胞孵箱培养2-4天后，弃去上清，肉眼可见细胞培养板底部形成细胞集落，随后巴氏滴管吸取新鲜培养基，滴管口紧贴侧壁加入培养基培养（避免冲散还未贴紧皿底的细胞集落）；
7、弃去上清，加入胰酶进行细胞消化，收集细胞悬液并离心；
8、弃上清，pbs重悬后再次离心；
9、弃上清后用pbs重悬细胞沉淀，滤网过滤后进行细胞计数，活细胞比例达标后进行流式分选；
10、加入流式分选cd45、cd11b、cd64抗体，进行孵育；
11、离心弃上清，加入心脏巨噬细胞体外培养基重悬细胞沉淀，再次过滤；
12、利用空白管细胞上机进行电压调节，单阳管进行补偿调节，流式分选仓为无菌环境，分选过程中谨遵无菌操作原则；
13、置细胞分选管于无菌分选仓，振荡强度选择低频率，细胞收集仓放置冰袋维持细胞活性；
14、分选完毕后进行复测，利用该方法分选初始心脏细胞的比例可达到80%以上，为后续分选节省大量时间；
15、重新接种细胞培养36-48h后进行相关检测。
16、所述的培养体系为含20 ng/ml巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-colonystimulating factor，m-csf），5 mm d-葡萄糖的dmem/f12培养基。
17、所述的细胞孵箱参数为37℃，5% co2。
18、所述的离心参数为4℃，400 g，离心5 min。
19、所述的活细胞比例为90%以上。
20、所述的孵育参数为4℃进行30 min。
21、所述的体外培养基含20 ng/ml转化生长因子β。
22、所述的滤网参数为40μm。
23、本专利技术的有益效果是：
24、实现了心脏巨噬细胞的体外长期培养和分离，并且在体外保持较高的活性，可利用该方法检测心脏巨噬细胞细胞在生理条件下和疾病状态下细胞因子分泌等功能，以期深入探究心脏巨噬细胞的独特功能。
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1.一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，所述的培养体系为含20 ng/ml巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage-Colony StimulatingFactor，M-CSF），5 mM D-葡萄糖的DMEM/F12培养基。
3.根据权利要求1所述的一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，所述的细胞孵箱参数为37℃，5% CO2。
4.根据权利要求1所述的一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，所述的离心参数为4℃，400 g，离心5 min。
5.根据权利要求1所述的一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，所述的活细胞比例为90%以上。
6.根据权利要求1所述的一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，所述的孵育参数为4℃进行30 min。
7.根据权利要求1所述的一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，所述的体外培养基含20 ng/mL转
8.根据权利要求1所述的一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，所述的滤网参数为40μm。
...【技术特征摘要】
1.一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，所述的培养体系为含20 ng/ml巨噬细胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulatingfactor，m-csf），5 mm d-葡萄糖的dmem/f12培养基。
3.根据权利要求1所述的一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特征在于，所述的细胞孵箱参数为37℃，5% co2。
4.根据权利要求1所述的一种体外高效分离小鼠心脏巨噬细胞的方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯永利，陈丽华，刘睿言，唐康，郭蓉蓉，傅昭粤，张慧媛，裴建明，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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