【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于多组学分析，尤其涉及一种多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法。
技术介绍
1、目前，魔芋(amorphophallus spp.)是天南星科多年生草本植物，在中国、印度和日本等亚洲热带和亚热带国家作为经济作物广泛种植(zhang et al.，2022)。魔芋葡甘聚糖(kgm)是从魔芋球茎中提取的一种水溶性多糖(膳食纤维)，在食品科学和营养学、生物技术、医药工业和精细化工等领域有着广泛的应用(behera and ray，2016；zhu，2018)。中国是世界上最大的魔芋种植国和生产国，占世界总产量的60％。然而，由pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum(pcc)引起的细菌性软腐病是一种严重危害魔芋生产的广布性、灾难性病害，也被称为魔芋的“癌症”。pcc侵染可魔芋植株的所有部分(叶片、叶柄以及块茎)，通常产生叶片黄化和萎蔫、叶柄内部组织及地下球茎软腐的症状，随后全株死亡腐烂。田间平均发病率35％以上，可造成魔芋减产达30～70％，甚至绝收；更严重的是，在贮藏期魔芋也会被侵染造成块茎发病腐烂，给农民造成非常巨大的经济损失(wei et al.，2022；gao et al.，2022吴旭等，2018)。总之，软腐病严重影响着我国的魔芋栽培和kgm的生产，是制约我国魔芋产业发展的主要因素之一。
2、近年来，植物-病原菌的互作研究为病害的出现、基因的变化、植物和微生物的潜在防御机制提供了许多有价值的见解，了解致病机理和寄主防御机制将有助于提高植物
3、在现代农业实践中，控制寄主植物的抗病性被认为是一种有希望的替代方法和一种更环保的方法。目前对抗病性的认识主要是从所谓的病害三角的植物-病原体相互作用的二元模型中获得的；已知它涉及pamp触发免疫(pti)和与复杂信号串扰相关的效应触发免疫(eti)。但近年来，随着植物生物学和微生物相互作用的研究，增加了更多与病害发生有关的因素，揭示了一个超越寄主和入侵者的极其复杂的系统，被描述为“病害金字塔”，在这个系统中非生物因素如气候、土壤养分有效性、水分供应和昼夜节律，以及生物因素如昆虫、植物同一或远端部分的其他病原体和植物微生物群的存在，都结合在一起作为时间函数共同影响寄主-病原体相互作用(castro-moretti et al.，2020)。
4、多组学研究可以加深对各种非生物和生物因素如何影响植物-病原体相互作用的理解。在先前的研究中，rna-seq测序发现小生长素上调rna(saur)、乙烯反应性转录因子1(erf1)、4-香豆素酸辅酶a连接酶(4cl)、wrky转录因子、丝裂原激活蛋白激酶(mapk)基因等可能参与魔芋pcc感染后的能量调节、氧化应激和信号转导。在其他作物上有很多好的经验值得借鉴，较多的研究借助转录组学和代谢组学关联分析解析了病原菌胁迫下黄精、番茄、花椒等植株基因和代谢物的应答机制；同时，越来越多的学者强调了植物相关微生物群在植物-病原物互作中的重要作用：有益微生物通过直接(通过与病原体相互作用)或间接(通过激活寄主植物的先天免疫反应)作用保护植物免受病原体的攻击(trivedi et al.2020；li et al.，2021；noman et al.，2021)；植物微生物组与代谢组关联分析在全面阐释植物如何选择微生物和抵御病原体方面提供了重要作用：植物可以通过分泌各种代谢产物来影响其微生物群，微生物群反过来也可能影响寄主植物的代谢群，二者共同影响着植物响应生物/非生物胁迫的能力(pang et al.，2021；jacoby et al.，2021；wen et al.，2022)。将抗病相关基因表达模式、代谢产物的产生与微生物群落调控相结合，将为魔芋响应pcc侵染的植物-代谢产物-微生物群落的病害综合调控模式提供新的见解。然而，目前尚未对魔芋响应pcc侵染进行过植物-代谢产物-微生物的综合研究。
5、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：果胶杆菌属(pectobacteriumspp.)是一种植物坏死性细菌病原体，可导致极具破坏性的植物病害，在全球范围内造成大田作物、各种蔬菜、水果和观赏植物的严重损失，被认为是十大最危险的植物致病菌之一。pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum(pcc)是魔芋最具破坏性的细菌病原体之一，尽管这种细菌很重要，但植物与病原体相互作用的潜在机制尚不清楚。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法。
2、本专利技术是这样实现的，一种多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法，所述多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法在转录水平上利用rna-seq测序平台构建了抗感两种魔芋材料不同pcc侵染阶段的基因表达谱；利用lc/ms-ms分析了抗感两种魔芋材料在代谢水平上对pcc侵染的响应；进行组学之间的关联分析，解析敏感和抗性魔芋对pcc胁迫的响应机制。
3、进一步，所述多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法的结果显示pcc胁迫下，敏感a.konjac和抗性a.muelleri表现出相似的分子反应，两种魔芋体内多条防御途径被激活，植物激素信号转导以及抗病物质代谢是魔芋抗pcc侵染的重要分子机制；两种魔芋材料的响应差异体现在mapk信号通路、植物激素信号转导通路中mapk4、rte1、ein3关键基因的表达水平在感染前和感染后均表现为抗性a.muelleri高于敏感a.konjac；对于果胶杆菌属的物种，ja/et-和sa-介导的信号通路对防御反应有积极影响。
4、进一步，所述多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法显示pcc的侵染导致魔芋代谢调整，多种免疫相关和抗菌的植物化合物在受侵染后的组织中被鉴定到，两种魔芋材料之间的差异表现在化合物的积累量不同；与抗菌、抗炎、抗氧化相关的代谢物仅在抗病的a.muelleri中差异积累，a.muelleri抵御pcc侵染的潜在抗性物质；
5、pcc胁迫下两种魔芋叶柄组织内微生物群落发生变化，首先，细菌群落中，感染后两种魔芋的sphingomonas和microbacterium的ra均较健康对照显著降低，但两种魔芋相比较时，二者的ra在感染前和感染后抗病a.muelleri均显著高于感病的a.konjac。
6、进一步，所述多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法解析敏感和抗性魔芋对pcc胁迫的响应机制，包括3个方面：(1)植物激素信号转导和抗病物质代谢是两种魔芋分子抗病机制的重要组成部分，ja信号通路同时参与两种魔芋对软腐病的防御反应；(2)pcc胁迫下，抗感两种本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法在转录水平上利用RNA-Seq测序平台构建了抗感两种魔芋材料不同Pcc侵染阶段的基因表达谱；利用LC/MS-MS分析了抗感两种魔芋材料在代谢水平上对Pcc侵染的响应；进行组学之间的关联分析，解析敏感和抗性魔芋对Pcc胁迫的响应机制。
2.如权利要求1所述的多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法的结果显示Pcc胁迫下，敏感A.konjac和抗性A.muelleri表现出相似的分子反应，两种魔芋体内多条防御途径被激活，植物激素信号转导以及抗病物质代谢是魔芋抗Pcc侵染的重要分子机制；两种魔芋材料的响应差异体现在MAPK信号通路、植物激素信号转导通路中MAPK4、RTE1、EIN3关键基因的表达水平在感染前和感染后均表现为抗性A.muelleri高于敏感A.konjac；对于果胶杆菌属的物种，JA/ET-和SA-介导的信号通路对防御反应有积极影响。
3.如权利
4.如权利要求1所述的多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法解析敏感和抗性魔芋对Pcc胁迫的响应机制，包括3个方面：(1)植物激素信号转导和抗病物质代谢是两种魔芋分子抗病机制的重要组成部分，JA信号通路同时参与两种魔芋对软腐病的防御反应；(2)Pcc胁迫下，抗感两种魔芋上调了苯丙烷、类黄酮以及MeJA生物合成相关基因的转录水平，同时激活相关代谢途径中苯丙烷类、黄酮类关键代谢物累积，代谢物在抗炎、抗菌、抗氧化或者支持细胞壁加固方面具有重要作用；(3)苯丙烷类和黄酮类代谢物与两种魔芋内生细菌、真菌群落呈正/负相关性，参与介导微生物群落间的相互作用或影响微生物群落组成。
5.如权利要求1所述的多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法使用的软腐病病原菌Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum菌株EccK-23B，登录号:MN653919，将菌株活化后，接种到Luria-Bertani(LB)肉汤胰蛋白10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L和pH7.0±0.2)中摇培过夜，然后用无菌蒸馏水稀释至细胞浓度为1×108CFU/mL，用于接种植物；
6.如权利要求5所述的多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法魔芋总RNA提取、文库制备及转录组测序参照Reagent(Invitrogen)试剂盒步骤提取魔芋叶柄组织中的总RNA，用NanoDrop2000对所提的RNA的纯度和浓度进行检测，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，用Agilent5300生物分析仪检测RNA的完整性；提取出的RNA一部分用于转录组测序，另一部分用于验证转录组结果的qPCR实验；总RNA经Oligo(dT)纯化后，经PCR扩增制备测序文库；通过TBS380定量后，用Illumina HiseqTM2500进行测序；测序完成后，利用SeqPrep软件对原始数据进行过滤，获得有效序列；使用HISAT2软件将筛选后的序列与参考基因组进行比较，使用软件RSEM对基因的表达水平进行定量分析，使用DESeq2软件对基因表达差异进行分析，FDR<0.05&|log2FC|≧1时被视为DEGs；
7.如权利要求1所述的多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群落综合响应的方法的转录组和代谢组的关联分析，利用京都基因与基因组百科全书数据库对差异基因和差异代谢物进行功能注释和富集分析，使用超几何分布算法获得基因集中的基因显著富集的通路及代谢集中代谢物显著富集，采用BH方法对P值进行校正，当经过校正的P值＜0.05时，认为通路存在显著富集情况；
8.如权利要求7所述的多组学分析抗感魔芋对Pcc侵染的群...
【技术特征摘要】
1.一种多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法在转录水平上利用rna-seq测序平台构建了抗感两种魔芋材料不同pcc侵染阶段的基因表达谱；利用lc/ms-ms分析了抗感两种魔芋材料在代谢水平上对pcc侵染的响应；进行组学之间的关联分析，解析敏感和抗性魔芋对pcc胁迫的响应机制。
2.如权利要求1所述的多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法的结果显示pcc胁迫下，敏感a.konjac和抗性a.muelleri表现出相似的分子反应，两种魔芋体内多条防御途径被激活，植物激素信号转导以及抗病物质代谢是魔芋抗pcc侵染的重要分子机制；两种魔芋材料的响应差异体现在mapk信号通路、植物激素信号转导通路中mapk4、rte1、ein3关键基因的表达水平在感染前和感染后均表现为抗性a.muelleri高于敏感a.konjac；对于果胶杆菌属的物种，ja/et-和sa-介导的信号通路对防御反应有积极影响。
3.如权利要求1所述的多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法显示pcc的侵染导致魔芋代谢调整，多种免疫相关和抗菌的植物化合物在受侵染后的组织中被鉴定到，两种魔芋材料之间的差异表现在化合物的积累量不同；与抗菌、抗炎、抗氧化相关的代谢物仅在抗病的a.muelleri中差异积累，a.muelleri抵御pcc侵染的潜在抗性物质；
4.如权利要求1所述的多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法解析敏感和抗性魔芋对pcc胁迫的响应机制，包括3个方面：(1)植物激素信号转导和抗病物质代谢是两种魔芋分子抗病机制的重要组成部分，ja信号通路同时参与两种魔芋对软腐病的防御反应；(2)pcc胁迫下，抗感两种魔芋上调了苯丙烷、类黄酮以及meja生物合成相关基因的转录水平，同时激活相关代谢途径中苯丙烷类、黄酮类关键代谢物累积，代谢物在抗炎、抗菌、抗氧化或者支持细胞壁加固方面具有重要作用；(3)苯丙烷类和黄酮类代谢物与两种魔芋内生细菌、真菌群落呈正/负相关性，参与介导微生物群落间的相互作用或影响微生物群落组成。
5.如权利要求1所述的多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法使用的软腐病病原菌pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum菌株ecck-23b，登录号:mn653919，将菌株活化后，接种到luria-bertani(lb)肉汤胰蛋白10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l和ph7.0±0.2)中摇培过夜，然后用无菌蒸馏水稀释至细胞浓度为1×108cfu/ml，用于接种植物；
6.如权利要求5所述的多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法，其特征在于，所述多组学分析抗感魔芋对pcc侵染的群落综合响应的方法魔芋总rna提取、文库制备及转录组测序参照reagent(invitrogen)试剂盒步骤提取魔芋叶柄组织中的总rna，用nanodrop2000对所提的rna的纯度和浓度进行检测，用琼脂糖凝胶电泳检测rna的质量，用agilent5300生物分析仪检测r...
【专利技术属性】
技术研发人员：余磊，郭建伟，黄飞燕，齐颖，赵永腾，高鹏华，李丽芳，杨敏，刘佳妮，陈泽斌，余亚军，林登智，寸德馨，
申请(专利权)人：昆明学院，
类型：发明
国别省市：
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