【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及中医药，尤其涉及一种用于鉴定麻黄广肩小蜂的dna条形码标准检测片段及其应用。
技术介绍
1、草麻黄（ ephedra sinica stapf）为麻黄属多年生草本状灌木，是2020版《中国药典》收载的药材麻黄品种之一。其根系发达，能在濒临沙化的草原上顽强生长，地上和地下部分均能入药，具有生态、药用和经济等巨大价值。目前，市场上流通的麻黄商品和人工栽培品的品种大多为草麻黄。人工栽培大部分通过种子繁育，而草麻黄种子自然发芽率低，常年遭受各种生物胁迫。麻黄广肩小蜂（ eurytoma sp.）是危害麻黄种子的最严重的生物之一。它的危害方式主要是将卵产在麻黄种子内，卵孵化为幼虫后以种胚为食，导致种子丧失萌发能力，提高了麻黄的种植成本，不仅影响了麻黄的种植扩张，还阻碍了麻黄种子产业的发展壮大。
2、因此，亟需一种能够准确鉴定麻黄广肩小蜂的方案，以准确发现麻黄种子是否受到了麻黄广肩小蜂的危害，进而采用相应的防治措施。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种用于鉴定麻黄广肩小蜂的dna条形码标准检测片段及其应用，该dna条形码标准检测片段可以准确地从麻黄种子中鉴定麻黄广肩小蜂，进而可以针对被鉴定出麻黄广肩小蜂的麻黄种子所在的区域（例如种植园、仓储等），采用针对麻黄广肩小蜂的病虫害杀灭措施。
2、本专利技术第一方面，提供了一种于鉴定麻黄广肩小蜂的dna条形码标准检测片段，dna条形码
3、其中，dna条形码标准检测片段为细胞色素c氧化酶亚基i (cytochrome coxidasesubunit i，coi)基因片段。
4、本专利技术第二方面，提供了一种用于扩增第一方面所述的dna条形码标准检测片段的引物对，其中，所述引物对中，正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
5、本专利技术第三方面，提供了一种利用第一方面所述的dna条形码标准检测片段鉴定麻黄广肩小蜂的方法，包括以下步骤：
6、（1），获取草麻黄虫蛀种子；
7、（2），提取所述草麻黄虫蛀种子中的动物dna；
8、（3），使用权利要求2所述的引物对，以提取到的动物dna为pcr扩增的模板，进行pcr扩增，得到扩增产物；
9、（4），使用琼脂糖凝胶电泳技术，得到从所述扩增产物中得到条带位置为500-750bp的产物；
10、（5），对条带位置为500-750bp的产物进行测序，得到所述dna条形码标准检测片段；
11、（6），利用所述dna条形码标准检测片段构建系统发育树，以确定所述dna条形码标准检测片段所属的物种。
12、在一些实施例中，所述获取草麻黄虫蛀种子包括：
13、(11)获取草麻黄种子在x射线辐射下的x射线影像图档;
14、(12)加强所述x射线影像图档明暗对比度，获得草麻黄种子影像；
15、(13)对草麻黄种子影像进行人工识别，得到草麻黄虫蛀种子。
16、在实施例的一个示例中，所述获取草麻黄种子在x射线辐射下的x射线影像图档包括：设置曝光模式为全自动；工作电压21 kv；扫描时间1 s；工作电流1.50 ma；将麻黄种子整齐排列，种子腹部朝下，放置样本检测箱，以获取麻黄种子x射线影像图档。
17、在一些实施例中，所述提取所述草麻黄虫蛀种子中的动物dna包括以下步骤：
18、将草麻黄虫蛀种子，放入研钵加入液氮，迅速研磨成粉末，取25mg-100mg粉末装入1.5ml离心管中；
19、添加180微升的atl溶液，20微升蛋白酶k，金属浴56℃孵育2-3小时，使组织完全溶解；涡旋15秒，加入200微升缓冲液al，颠倒混匀；加入200微升无水乙醇，涡旋混匀，得到混合物；
20、将混合物转移至dnease mini旋转柱，放置在2ml的收集管中，在台式高速离心机上12000r/min，离心1min，弃掉废液；将旋转柱放入新的2ml收集管中，加入500微升缓冲液aw1，在台式高速离心机上12000r/min，离心1min，弃掉废液；将旋转柱放入新的2ml收集管中，加入500微升缓冲液aw2，在台式高速离心机上14000r/min，离心3min，弃掉废液；将旋转柱放入新的1.5ml离心管中，加入200微升ae洗脱液室温孵育1min，分4次洗脱，每次50微升以提高dna产量。
21、在一些实施例中，所述pcr扩增具体为：
22、扩增体系采用25 μl 体系，其中，包括12.5 μl pcr mastermix、8.5 μl ddh2o、正反引物各1 μl，2 μl dna 模板；
23、pcr 反应条件为 94 ℃ 预变性 1min；94 ℃ 变性 1 min，45℃ 退火 1.5 min，72 ℃ 延伸 1.5 min，5 个循环；94 ℃ 变性 1 min，50℃ 退火 1.5 min，72 ℃ 延伸 1min，35 个循环；最后 72 ℃ 延伸 5 min，置4℃ 保存。
24、在一些实施例中，所述使用琼脂糖凝胶电泳技术，得到从所述扩增产物中得到条带位置为500-750bp的产物，包括：
25、取2μl的pcr扩增产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳；电泳条件为：120v电压，电泳20分钟；
26、电泳结束后，凝胶使用溴化乙锭染色;并置于凝胶成像系统检测，割取条带位置在500-750bp的凝胶，得到条带位置为500-750bp的产物。
27、第四方面，提供了第一方面所述的dna条形码标准检测片段在麻黄广肩小蜂鉴定中的应用。
28、第五方面，提供了第二方面所述的引物对在麻黄广肩小蜂鉴定中的应用。
29、本专利技术提供的方案具有如下优点：
30、(1)本专利技术获得的dna条形码标准检测片段有利于快速实现麻黄种子小蜂的分子鉴定，能有效缩短该昆虫的鉴定时间；
31、(2)首次使用x射线应用于麻黄虫蛀种子的检测；
32、(3)克服了以下现有技术中的不足之处：对麻黄种子小蜂幼虫需要培养为成虫才能鉴定，耗时较长；对残缺不全的昆虫样品、虫体粉末基本上不能检测；以传统分类学方法鉴定麻黄种子小蜂要求掌握广肩小蜂属昆虫形态分类学的专业技术人员才能对其进行鉴定；
33、(4)本专利技术提供的pcr扩增程序和反应体系重复性高，经多次试验证实其稳定性好；且该关键技术易于掌握，方法简便、可靠、速度快，大大提高了鉴定效率，便于企业在麻黄种植、采收和种子质量控制等大生产中予以实施；
34、(5)本专利技术提供的分子鉴定方法从根本上解决了当前麻黄种子小蜂难以进行快速准确鉴定的难题，对麻黄种子及其贮存运输的规范管理具有重要意义。本专利技术基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴定麻黄广肩小蜂的DNA条形码标准检测片段，其特征在于，DNA条形码标准检测片段的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种用于扩增权利要求1所述的DNA条形码标准检测片段的引物对，其中，所述引物对中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.利用权利要求1所述的DNA条形码标准检测片段鉴定麻黄广肩小蜂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述获取草麻黄虫蛀种子包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述获取草麻黄种子在X射线辐射下的X射线影像图档包括：
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述提取所述草麻黄虫蛀种子中的动物DNA包括以下步骤：
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增具体为：
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述使用琼脂糖凝胶电泳技术，得到从所述扩增产物中得到条带位置为500-750bp的产物，包括：
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10.权利要求2所述的引物对在麻黄广肩小蜂鉴定中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定麻黄广肩小蜂的dna条形码标准检测片段，其特征在于，dna条形码标准检测片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种用于扩增权利要求1所述的dna条形码标准检测片段的引物对，其中，所述引物对中，正向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示。
3.利用权利要求1所述的dna条形码标准检测片段鉴定麻黄广肩小蜂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述获取草麻黄虫蛀种子包括：
5.根据权利要求4所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐江，肖厚红，胡灏禹，陈士林，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：
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