一种肿瘤解离试剂在流式细胞检测中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种肿瘤组织解离试剂，所述解离试剂成分不包含胶原酶和胰酶，但其成分还包含透明质酸酶或透明质酸酶和DNA酶I二者的混合物。本发明专利技术还公开了采用上述解离试剂分散肿瘤组织并用于流式细胞检测细胞表面分子标记物的表达程度。本发明专利技术的解离试剂不会造成细胞表面分子标记物如CD8、PD‑1、Tim‑3、Lag‑3等的降解，从而不影响下游实验检测。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤解离试剂在流式细胞检测中的应用
本专利技术涉及一种将临床实体肿瘤组织分散成单细胞悬液，并保护表面标志物不被降解且可被用于流式检测的肿瘤解离试剂。
技术介绍
在对肿瘤组织的细胞生物学特性进行分析研究(如细胞表位检测等)时，需先将样品组织块制备成分散的单细胞悬液，获得高得率的细胞，并且细胞及表位的完整性保留完好，可直接用于下游实验。只有当样品组织中的各种细胞成分处在单细胞状态下，才能有效地对其进行各种细胞效应的检测分析，而细胞悬液质量的好坏与消化液配方和消化方法密切相关。目前常用的单细胞悬液制备方法有化学法、酶法和物理法。酶学法主要是破坏细胞间的连接物如胶原酶、弹性纤维、粘多糖物质、紧密连接装置蛋白等而使细胞分散。胰酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶等是目前常用的酶。现有技术中，商品化的解离试剂盒如美天旎组织解离试剂盒据称可以处理多种组织，包括肿瘤组织、骨骼肌、脾、肺、神经组织、表皮、固有层组织、新生鼠心脏、新生神经元及拟胚体等组织，并且根据细胞表面的抗原对酶消化的敏感性不同还设计了不同的酶反应体系，以尽可能保护细胞表面抗原不被破坏，从而不影响下游实验。而事实上，实际操作中仍存在会降解或部分降解某些细胞表面分子标记物，使得无法准确检测。事实上，一些常用的酶解试剂的成分会影响细胞表面分子标记物的检测。例如，胰酶对细胞的分散能力强，作用时间短，应用胰酶制备单细胞悬液产量高，但胰酶的作用条件复杂，胰酶对细胞表面抗原甚至对细胞均有破坏作用。例如，经胰酶处理小鼠胸腺细胞表面受体CD4和CD8会被胰酶消化切割掉(ThomasBarthlott,RebeccaJ.WrightandBrigittaStockinger，JImmunol，1998年第161期3992-3999页)。因此胰酶适用于检测检测细胞内抗原，对于细胞表面抗原，尤其是弱表达抗原检测并不适宜。免疫检查点蛋白是肿瘤治疗中的关键靶点，在免疫治疗中起到非常重要的作用，可能成为人类征服癌症的有力武器。正是如此，癌症的诊断和治疗都要求对其检测的准确性。而对临床肿瘤病人进行诊断并确定下一步的治疗方案(特别是靶向治疗)的过程中，流式细胞计数方法由于其能同时检测单个细胞上多种标志物，所以在对样本细胞亚群进行细分和细胞表面标志物的确定方面有其它技术难以比拟的优势。但是，肿瘤组织需要经过消化酶处理成单细胞悬液后才能用于后续的流式检测。而在本专利技术中，我们发现目前商品化的人源肿瘤消化试剂或常用的消化试剂如胶原酶都对本专利中涉及的多种蛋白(包括免疫检查点蛋白如Tim-3和Lag3)的表达水平都有明显影响，这无疑加大了疾病的误诊率，容易导致错误的治疗方案。因此各消化液对肿瘤组织的消化效果和对细胞表面抗原的保护作用尚有待改进。找到一种消化酶或混合物能有效的消化人源肿瘤组织并且不影响表面标志物的表达至关重要。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供了一种肿瘤解离试剂。其中，该解离试剂不包含胶原酶且包含透明质酸酶，所述肿瘤解离试剂不降解或不部分降解检查点受体等膜表面受体。本专利技术同时公开了另一种肿瘤解离试剂，其不包含胰蛋白酶和胶原酶且包含透明质酸酶，所述肿瘤解离试剂不降解或不部分降解检查点受体等膜表面受体。其中，本专利技术所述的透明质酸酶的浓度范围优选为1mg/mL以下，透明质酸酶浓度更优选为1ug/mL至1mg/mL。本专利技术还公开了一种肿瘤解离试剂，其还包含DNA酶I。其中，本专利技术所述的DNA酶I的浓度范围优选为20mg/mL以下，DNA酶I浓度更优选为0.01ug/mL至20mg/mL。在本专利技术的一个实施例中，该解离试剂不降解或不部分降解检查点受体等膜表面受体中所述膜表面受体，包括但不限于检查点受体CD8、PD-1，PD-L1，TIM-3和LAG-3蛋白中的一种或多种。本专利技术的目的之二在于提供一种制备方法，其中，该方法可以避免降解肿瘤组织中免疫检查点标志物，其中使用了本专利技术公开的所述肿瘤解离试剂处理细胞。本专利技术的目的之三在于公开了所述的肿瘤解离试剂在检测肿瘤组织中免疫检查点标记物表达的用途，优选地在流式细胞术检测肿瘤组织中的蛋白表达的用途。在本专利技术中，所述肿瘤组织为肿瘤浸润免疫细胞。在本专利技术中，所述蛋白为膜表面受体为检查点受体。在本专利技术的一个实施例中，在流式细胞术检测肿瘤组织中所述膜表面受体为检查点受体包括但不限于CD8、PD-1，PD-L1，TIM-3和LAG-3蛋白中的一种或多种。本专利技术的目的之四在于提供一种用于肿瘤解离的试剂盒，其包括本专利技术所述的肿瘤解离试剂。本专利技术同时公开了所述的试剂盒在流式细胞术检测肿瘤组织中蛋白表达的用途。本专利技术的一个实施例公开了一种用于流式细胞术的肿瘤解离方法，包括使用本专利技术所述的肿瘤解离试剂来解离肿瘤组织。在该方法中，所述肿瘤组织为肿瘤浸润免疫细胞。专利技术的有益效果本专利技术的有益效果在于所建立了不含胶原酶和胰酶的肿瘤解离试剂，该解离试剂不会降解或部分降解肿瘤组织中膜表面标志物，因此可以采用该肿瘤解离试剂在流式细胞术检测肿瘤组织中蛋白的表达。附图说明图1是示出不同消化酶处理后辅助T细胞(CD4+)中的检查点蛋白PD-1、Tim-3和Lag-3的流式分析图。图2是示出不同消化酶处理后毒性T细胞(CD8+)中的检查点蛋白PD-1、Tim-3和Lag-3的流式分析图。图3是示出不同消化酶处理后细胞表面检查点蛋白的百分含量的统计图。图4是示出经二酶混合物处理后细胞表面检查点蛋白PD-1、Tim-3和Lag-3的百分含量的统计图。图5是示出不同消化酶处理后细胞表面检查点蛋白CD4和CD8的流式分析图。图6是示出不同酶消化处理后的细胞得率。具体实施方式下面通过具体实施方式及实验数据对本专利技术作进一步的说明。尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味着定义或限制本专利技术的范围。如本文中所使用，术语“解离试剂”指代酶消化试剂，在本专利技术中，肿瘤解离试剂指的是用酶消化液消化肿瘤组织为单个细胞悬液的酶消化试剂。如本文中所使用，术语“膜表面受体”指代的是细胞表面的一种或一类分子，它们能识别、结合专一的生物活性物质(称配体)，生成的复合物能激活和启动一系列物理化学变化，从而导致该物质的最终生物效应。细胞环境中各种因素的变化，是通过细胞膜受体的作用而影响细胞内的生理过程发生相应的变化。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。具体实施例：实施例1消化酶试剂的配制透明质酸酶消化缓冲体系：将50μL初始浓度为10mg/mL的透明质酸酶透明质酸酶(Hyaluronidase，购自sigma公司，货号H3506)溶液加到4.95mL的DMEM培养基中(终浓度为100μg/mL)配制成5mL肿瘤组织消化液。胶原酶D消化缓冲体系：将500μL初始浓度为10mg/ml的胶原酶D(CollagenaseD，购自Roche公司，货号11088882001)溶液加到4.5mL的DMEM培养基中(终浓度为1mg/mL)配制成5mL肿瘤组织消化液。DNA酶I消化缓冲体系：将50μL初始浓度为5mg/mL的DNA酶I溶液(DNAseI，购自sigma公司，货号DN25-1G)加到4.95mL的DMEM培养基中(终浓度为0.05mg/mL)配制成5mL肿瘤组织消化液。三酶混合物消化缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肿瘤解离试剂，其不包含胶原酶且包含透明质酸酶，所述肿瘤解离试剂不降解或不部分降解检查点受体等膜表面受体。

【技术特征摘要】
1.一种用于肿瘤解离的酶在制备用于检测肿瘤组织中免疫检查点标记物表达的试剂中的应用，其中，所述用于肿瘤解离的酶由透明质酸酶和DNA酶I中的至少一种组成，所述用于肿瘤解离的酶不降解或不部分降解免疫检查点标记物，所述免疫检查点标记物为CD8、PD-1，PD-L1、TIM-3和LAG-3蛋白中的一种或多种。2.如权利要求1所述的应用，所述透明质酸酶的浓度为100μg/mL以下，所述DNA酶I的浓度为50μg/mL以下。3.如权利要求1所述的应用，检测肿瘤组织中免疫检查点标记物表达的方法为流式细胞术检测。4.如权利要求1所述的应用，所述肿瘤组织为肿瘤浸润免疫细胞。5.一种用于肿瘤解离的酶在制备用于流式细胞术检测肿瘤组织中免疫检查点标志物表达的试剂盒中的应用，其中，所述用于肿瘤解离的酶由浓度为100μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宁，张祁尧，刘艳，冀群升，
申请(专利权)人：苏州药明康德新药开发股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32