抗肿瘤药物筛选试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种抗肿瘤药物筛选试剂盒及其使用方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术试剂盒包括：秀丽隐杆线虫、线虫培养基、大肠杆菌、染料。本发明专利技术利用染料2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯对突变体和野生型秀丽隐杆线虫不同的染色效果来达到操作简单、快速、高效、准确、高通量筛选出有效的抗肿瘤药物的目的，为广大抗肿瘤药物的研发人员节约了时间和成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗肿瘤药物筛选试剂盒及该试剂盒的使用方法，属于生物医药

技术介绍
众所周知，RAS信号途径是与肿瘤发生有关的信号通路。在人类肿瘤中，RAS蛋白的功能异常是普遍存在的。据报道，约50％的肺癌和肠癌中、95％胰腺癌中存在ras突变基因。若RAS蛋白持续处于活化状态，可与下游的效应蛋白结合，将信号传递到下游信号元件，可能引起细胞的异常增殖，导致肿瘤的发生。因此，RAS蛋白的信号通路成为筛选抗肿瘤药物新的靶点。肿瘤细胞系、永生化细胞以及原代培养细胞是研究肿瘤病因学和发病机制的重要模型。然而，许多的药物候选物体内活性和体外活性相关性很差。因此，药物的体外筛选在方法学上存在技术缺陷。而药物的体内筛选能够避免此类技术缺陷。因此，目前人们普遍利用小鼠作为模式生物来筛选抗癌药物，但是该方法却存在周期长，成本高，工作量大缺陷，难以实现高通量筛选。多项研究表明，秀丽隐杆线虫可以作为筛选能抑制ras原癌基因活性的药物的模式生物。但是现阶段使用秀丽隐杆线虫仍然存在一定的困难，主要原因是对于一般人来讲，秀丽隐杆线虫的的造模、培养、检验等仍需要系统的技术培训与实践，才能完成药物筛选，因此，大家急需一种以秀丽隐杆线虫为模型的抗肿瘤药物筛选试剂盒。本专利技术利用秀丽隐杆线虫为模式生物进一步完善了利用秀丽隐杆线虫作为模式生物，构建了秀丽隐杆线虫抗肿瘤药物筛选试剂盒，该抗肿瘤药物筛选试剂盒具有操作简单、快速、高效、准确、高通量的优点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗肿瘤药物筛选试剂盒，该试剂盒能够利用秀丽隐杆线虫实现抗肿瘤药物的体内筛选。本专利技术的另一个目的是提供上述抗肿瘤药物筛选试剂盒的使用方法，本专利技术利用染料H2DCF-DA对突变体和野生型秀丽隐杆线虫不同的染色效果来达到操作简单、快速、高效、准确、高通量筛选出有效的抗肿瘤药物的目的，为广大抗肿瘤药物的研发人员节约时间和成本。本专利技术公开的抗肿瘤药物筛选试剂盒包括如下材料：①秀丽隐杆线虫野生型N2；②秀丽隐杆线虫突变体MT2124；③秀丽隐杆线虫CB1275；④NGM培养基；⑤大肠杆菌OP50；⑥染料：2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯。其中，所述的肿瘤是由ras原癌基因过表达引起的。由于ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的RAS蛋白，它与人类的RAS蛋白相比具有83％的同源性。如果ras突变，在秀丽隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为肿瘤模型广泛应用于筛选抑制ras原癌基因通路过度激活的抗肿瘤药物。所述的试剂盒所用的秀丽隐杆线虫为同步化后的线虫，线虫同步化的步骤为：①挑选成熟的秀丽隐杆线虫至装有1mlM9液的离心管中，4000rpm离心5分钟，去上清；②向离心管中加入500μL1M氢氧化钠，500μL6.4％(V/V)次氯酸钠，震荡裂解；③去掉上清，向沉淀中加入1.5μLM9液，摇匀，4000rpm离心5分钟，重复该步骤三次；④向洗净的卵中加入500μLM9液，18℃24小时孵化成L1期秀丽隐杆线虫。其中，所述的秀丽隐杆线虫的浓度为100条/20μl。本专利技术提供的上述的抗肿瘤药物筛选试剂盒的使用方法，所述的试剂盒的使用方法为：(1)秀丽隐杆线虫的染色与检测将同步化后的L1期秀丽隐杆线虫MT2124混匀，计数单位液体体积中秀丽隐杆线虫的数目，备用；在96孔板上取2孔，每个孔中先加入140μL的S液，然后加入20μL大肠杆菌菌体溶液，每个孔中加入90条左右的秀丽隐杆线虫MT2124，第一个孔为阴性对照，加入20μL蒸馏水，另一个孔加入供试药物；最后使每个孔的液体体积都是200μL；然后将液体混匀，20℃振荡培养6天左右，待其发育为成虫，即产生假阴门后，用M液从平板上冲下，转移到离心管中，待秀丽隐杆线虫自然沉淀，除去上清液，留取秀丽隐杆线虫；加入含0.05％(V/V)的吐温20的M9液，待秀丽隐杆线虫自然沉淀，除去上清液，留取秀丽隐杆线虫；再用纯净的M9液洗涤至澄清，转移秀丽隐杆线虫到另外的新的96孔板上，加样位置与原来96板对应，每个孔做三个平行对照，加入染料，分别染色，染色后的秀丽隐杆线虫在荧光显微镜下观察，拍照；并且利用荧光酶标仪检测荧光值，激发光波长485nm，发射光波长535nm；(2)将实验数据进行处理，测量染色后的线虫荧光强度。其中，所述的秀丽隐杆线虫用染料染色时，染料终浓度为50μg/mL，染色时间为1.5小时，染色温度20℃。本专利技术的有益效果为：1.本专利技术是利用染料H2DCF-DA特异性对秀丽隐杆线虫假阴门染色，然后用荧光酶标仪检测秀丽隐杆线虫群体的荧光强度，能够实现高通量筛选，具有操作简单，数据客观准确的优点。2.由于许多的药物候选物体内活性和体外活性相关性很差，因此，药物的体外高通量筛选在方法学上存在技术缺陷。本专利技术采用秀丽隐杆线虫作为体内筛选药物的模式生物，解决了体外筛选药物的弊端，且相比于小鼠作为模式生物来筛选抗癌药物，周期短，成本低，操作简单，能高通量筛选出有效抗肿瘤药物，为广大抗肿瘤药物的研发人员节约时间和成本。附图说明图1为秀丽隐杆线虫突变体MT2124用染料染色1.5h的荧光照片；图2为秀丽隐杆线虫野生型N2用染料染色1.5h的荧光照片；图3为野生型比例不同的线虫群体染料染色的荧光值；图4为索拉菲尼验证抗肿瘤药物筛选试剂盒的结果；图5为索拉菲尼对Ras/MAPK通路多阴门突变体的影响。具体实施方式以下提供具体实施例以实现本专利技术所述的抗肿瘤药物筛选试剂盒，但不限于这些实施例。1.试剂(1)M9缓冲液(M9buffer)：每升缓冲液中含：12gNa2HPO4·12H2O(或6gNa2HPO4)，3gKH2PO4，5gNaCl，0.25gMgSO4·7H2O，宜现用现配。(2)S缓冲液(Sbuffer)：0.1mol/LNaC1，0.05mmol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH＝6.0)。(3)NGM(NematodeGrowthMedium)培养基：1.21gNaCl，<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤药物筛选试剂盒,所述的试剂盒包括如下材料：①秀丽隐杆线虫野生型N2；②秀丽隐杆线虫突变体MT2124；③秀丽隐杆线虫CB1275；④NGM培养基；⑤大肠杆菌OP50；⑥染料：2',7'‑二氯二氢荧光素二乙酯。

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤药物筛选试剂盒,所述的试剂盒包括如下材料：
①秀丽隐杆线虫野生型N2；
②秀丽隐杆线虫突变体MT2124；
③秀丽隐杆线虫CB1275；
④NGM培养基；
⑤大肠杆菌OP50；
⑥染料：2',7'-二氯二氢荧光素二乙酯。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物筛选试剂盒，其特征在于，
所述的肿瘤是由ras原癌基因过表达引起的。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物筛选试剂盒，其特征在于，
所述的试剂盒所用的秀丽隐杆线虫为同步化后的线虫，线虫同步化的
步骤为：
①挑选成熟的秀丽隐杆线虫至装有1mlM9液的离心管中，4000
rpm离心5分钟，去上清；
②向离心管中加入500μL1M氢氧化钠，500μL6.4％(V/V)次
氯酸钠，震荡裂解；
③去掉上清，向沉淀中加入1.5μLM9液，摇匀，4000rpm离
心5分钟，重复该步骤三次；
④向洗净的卵中加入500μLM9液，18℃24小时孵化成L1
期秀丽隐杆线虫。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物筛选试剂盒,其特征在于，
所述的秀丽隐杆线虫的浓度为100条/20μl。
5.如权利要求3所述的抗肿瘤药物筛选试剂盒的使用方法，其特

\t征在于，所述试剂盒的使用方法为：
(1)秀丽隐杆线虫的染色与检测
将如权利要求3所述同步化后的L1期秀丽隐杆线虫MT2124混匀，
计数单位液体体积中秀丽隐杆线虫的数目，备...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：兰州红菌生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62