一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒及其检测方法技术

一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒及其检测方法。本发明专利技术属于基因工程及肿瘤学领域，其检测方法是：(1)、血清中RNA的提取；(2)、小分子RNA的3'端多聚腺苷酸化；(3)、加尾产物纯化回收；(4)加尾产物的反转录反应；(5)、荧光定量PCR检验microRNA相对表达量；(6)、对荧光定量PCR结果进行分析；本发明专利技术具有高度的保守性、时空特异性、稳定性及组织特异性等特点，在疾病发病机制研究、早期诊断、个体化治疗和预后等方面发挥重要的作用，而且本发明专利技术操作简单、取材方便、安全无创伤，方便用于大量疾病的筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程及肿瘤学领域，涉及与人类多种肿瘤相关的血清microRNA标志物及其应用。
技术介绍
“谈癌色变”，这是大多数人对癌症的第一大态度；癌症一直以来都是威胁人类健康甚至生命的一大顽症；2016年1月25日，全球癌症领域顶级杂志《CA：临床医师癌症杂志》(CA Cancer J Clin)在线发表了国家癌症中心公布的2015年癌症统计数据显示：2015年中国预计有429.2万例新发肿瘤病例和281.4万例死亡病例，相当于平均每天12000人新患癌症、7500人死于癌症；鉴于此，我们亟需探索出肿瘤诊断和治疗的新方法。microRNA，又称为微小核糖核酸，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子；它主要通过与靶标基因3’UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，同时微小核糖核酸也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。细胞学中，每个microRNA可以有多个靶基因，或者几个microRNA也可以调节同一个基因；这种复杂的调节网络既可以通过一个microRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个MicroRNA的组合来精细调控某个基因的表达；microRNA因其高度的保守性、时空特异性、稳定性以及组织特异性等特点使其优于蛋白质、DNA片段等其他生物标志物，并且microRNA在疾病发病机制研究、早期诊断、个体化治疗和预后等方面发挥越来越重要的作用。目前已经发现并被miRBase数据库收录的人类microRNA分子有695种，其中绝大部分的microRNA分子在不同病理和生理状况下进行表达，并且多数microRNA能够在人体液中检出；有研究显示应用Solexa测序技术对正常的中国人血清microRNA进行测序分析，在男性和女性血清中分别发现了100种和91种microRNA分子，这就证明在了在人类的血清中存在着大量的microRNA，且这些microRNA在血清中通常是与蛋白质结合在一起，具有良好的稳定性；目前科学技术人员已经研究并研制出了多种有效的microRNA检测方法，如克隆测序、Northern杂交、microRNA芯片、实时荧光定量PCR等，这些检测方法都为microRNA作为生物标记物进行检测提供了依据。传统的肿瘤检测标志物多是激素类和蛋白类，如人绒毛膜促性腺激素(HCG)；促肾上腺皮质激素(ACTH)；甲胎蛋白(AFP)；癌胚抗原(CEA)；糖蛋白(CA125)和鳞状细胞癌相关抗原(SCC)等，但传统肿瘤标志物相对于microRNA作为肿瘤标志物进行检测的不足有：(1)传统肿瘤标志物不能在肿瘤发生早期准确检测，多是在中晚期辅助诊断；(2)检测多是针对肿瘤病变组织进行，无法达到无创的程度；(3)检测结果准确度不高；(4)检测不够便捷，步骤较复杂；(5)检测不能进行实时监控等，因此microRNA作为肿瘤标志物进行早期诊断有很大的优势，已经成为研究热点，根据资料及相关研究表明，前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌均受多种microRNA的调控，有的表明这些microRNA可能对于相关肿瘤的诊断具有指示作用，可以被看作为诊断上述癌症的潜在肿瘤标志物；然而，目前上述microRNA组合作为较为稳定的生物标志物用于多种癌症辅助早期诊断并研制相应的辅助早期诊断的试剂盒还未见报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的不足，提供了一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒及其检测方法；与传统的肿瘤检测标志物相比，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有高特异性、高灵敏性和易于大量筛查的特点，适合应用于前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌高危人群的筛选、鉴定、治疗状况及指导用药的监测等。本专利技术为了解决其技术问题所采用的技术方案是：一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒，所述的microRNA生物标志物及其检测的肿瘤包括：(1)、miR-21-5p、miR-141-3p、miR-221-3p、miR-375用于检测前列腺癌；(2)、miR-21-5p、miR-122-5p、miR-192-5p、miR-223-3p用于检测肝癌；(3)、miR-17-3p、miR-92a-3p、miR-29a-3p用于检测结肠直肠癌；(4)、miR-155-5p、miR-141-3p用于检测肾癌；(5)、miR-17-5p、miR-106a-5p、miR-378a-5p、miR-21-5p用于检测胃癌；(6)、miR-21-5p、miR-21-5p、miR-210-5p、miR-196a-5p用于检测胰腺癌；(7)、miR-21-5p、miR-210-5p、miR-223-3p、miR-25-3p、miR-30d-5p、miR-375、miR-499a-5p、miR-486-5p用于检测肺癌；(8)、miR-10b-5p、miR-16-1-5p、miR-106a-5p、miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-155-5p、miR-195-5p、miR-222-3p、miR-25-3p用于检测乳癌；(9)、miR-92a-3p、miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-155-5p、miR-93-5p、miR-127-3p、miR-126-3p用于检测卵巢癌；(10)、miR-21-5p、miR-375、miR-17用于检测食管癌；(11)、miR-21-5p、miR-155-5p用于检测DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤；(12)、miR-92a-3p、miR-638用于检测白血病；(13)、miR-15a、miR-16-1-5p用于检测CLL慢性淋巴细胞白血病；(14)、miR-184、miR-31-5p用于检测舌鳞状细胞癌。其检测方法，包括以下具体步骤：(1)、血清中RNA的提取：抽取14组病患和3名正常人血液各2毫升，每组病患包含3名病患，所述14组病患分别患有前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌；共45例；将上述抽取的各组血液分别放置于45个试剂管中凝血后进行离心5-10min，静置，离心后的血液分为上层血清层、中层白细胞和血小板层、下层红细胞层，共三层；后摄取各试剂管中的上层血清层1ml，将各试剂管中分别摄取的1ml的血清层分别置于新取的45个1.5ml的无DNA和RNA污染的离心管中，再对各试剂管中的血清进行RNA的提取；最后，对提取的各RNA再进行电泳、浓度及纯度的测定；(2)、小分子RNA的3'端多聚腺苷酸化：另取45个1.5ml无DNA和RNA污染的离心管，在各离心管中分别加入步骤(1)中所提取的RNA5μg、10×Poly(A)加尾酶缓冲液10μl、Poly(A)加尾酶10U、10mMrAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒,其特征在于，所述的microRNA生物标志物及其检测的肿瘤包括：(1)、miR‑21‑5p、miR‑141‑3p、miR‑221‑3p、miR‑375用于检测前列腺癌；(2)、miR‑21‑5p、miR‑122‑5p、miR‑192‑5p、miR‑223‑3p用于检测肝癌；(3)、miR‑17‑3p、miR‑92a‑3p、miR‑29a‑3p用于检测结肠直肠癌；(4)、miR‑155‑5p、miR‑141‑3p用于检测肾癌；(5)、miR‑17‑5p、miR‑106a‑5p、miR‑378a‑5p、miR‑21‑5p用于检测胃癌；(6)、miR‑21‑5p、miR‑21‑5p、miR‑210‑5p、miR‑196a‑5p用于检测胰腺癌；(7)、miR‑21‑5p、miR‑210‑5p、miR‑223‑3p、miR‑25‑3p、miR‑30d‑5p、miR‑375、miR‑499a‑5p、miR‑486‑5p用于检测肺癌；(8)、miR‑10b‑5p、miR‑16‑1‑5p、miR‑106a‑5p、miR‑21‑5p、miR‑29a‑3p、miR‑155‑5p、miR‑195‑5p、miR‑222‑3p、miR‑25‑3p用于检测乳癌；(9)、miR‑92a‑3p、miR‑21‑5p、miR‑29a‑3p、miR‑155‑5p、miR‑93‑5p、miR‑127‑3p、miR‑126‑3p用于检测卵巢癌；(10)、miR‑21‑5p、miR‑375、miR‑17用于检测食管癌；(11)、miR‑21‑5p、miR‑155‑5p用于检测DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤；(12)、miR‑92a‑3p、miR‑638用于检测白血病；(13)、miR‑15a、miR‑16‑1‑5p用于检测CLL慢性淋巴细胞白血病；(14)、miR‑184、miR‑31‑5p用于检测舌鳞状细胞癌。...

【技术特征摘要】
1.一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒,其特征在于，所述的microRNA生物标志物及其检测的肿瘤包括：(1)、miR-21-5p、miR-141-3p、miR-221-3p、miR-375用于检测前列腺癌；(2)、miR-21-5p、miR-122-5p、miR-192-5p、miR-223-3p用于检测肝癌；(3)、miR-17-3p、miR-92a-3p、miR-29a-3p用于检测结肠直肠癌；(4)、miR-155-5p、miR-141-3p用于检测肾癌；(5)、miR-17-5p、miR-106a-5p、miR-378a-5p、miR-21-5p用于检测胃癌；(6)、miR-21-5p、miR-21-5p、miR-210-5p、miR-196a-5p用于检测胰腺癌；(7)、miR-21-5p、miR-210-5p、miR-223-3p、miR-25-3p、miR-30d-5p、miR-375、miR-499a-5p、miR-486-5p用于检测肺癌；(8)、miR-10b-5p、miR-16-1-5p、miR-106a-5p、miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-155-5p、miR-195-5p、miR-222-3p、miR-25-3p用于检测乳癌；(9)、miR-92a-3p、miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-155-5p、miR-93-5p、miR-127-3p、miR-126-3p用于检测卵巢癌；(10)、miR-21-5p、miR-375、miR-17用于检测食管癌；(11)、miR-21-5p、miR-155-5p用于检测DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤；(12)、miR-92a-3p、miR-638用于检测白血病；(13)、miR-15a、miR-16-1-5p用于检测CLL慢性淋巴细胞白血病；(14)、miR-184、miR-31-5p用于检测舌鳞状细胞癌。2.一种权利要求1所述的一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒的检测方法,其特征在于，包括以下具体步骤：(1)、血清中RNA的提取：抽取14组病患和3名正常人血液各2毫升，每组病患包含3名病患，所述14组病患分别患有前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌；共45例；将上述抽取的各组血液分别放置于45个试剂管中凝血后进行离心5-10min，静置，离心后的血液分为上层血清层、中层白细胞和血小板层、下层红细胞层，共三层；后摄取各试剂管中的上层血清层1ml，将各试剂管中分别摄取的1ml的血清层分别置于新取的45个1.5ml的无DNA和RNA污染的离心管中，再对各试剂管中的血清进行RNA的提取；最后，对提取的各RNA再进行电泳、浓度及纯度的测定；(2)、小分子RNA的3'端多聚腺苷酸化：另取45个1.5ml无DNA和RNA污染的离心管，在各离心管中分别加入步骤(1)中所提取的RNA5μg、10×Poly(A)加尾酶缓冲液10μl、Poly(A)加尾酶10U、10mMrATP10μl，无RNA酶的水补足到100μl；得45份3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA；(3)、加尾产物纯化回收：1)、在上述步骤(2)得到的45份3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA的离心管中分别加入含有酚:氯仿:异戊醇三者、共500ul的混合物，漩涡振荡器振荡离心管10s，后再行冰浴10min，4℃、12000转/秒离心20min，得到小分子RNA、酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，上述混合溶液分成三层，其中，所述酚:氯仿:异戊醇的比例是25：24：1；2)、再取新的45个1.5ml无DNA和RNA污染的离心管，将步骤1)中所得到的三层溶液中的上层溶液水相吸至新取离心管中，用移液枪计量体积，后在新取离心管中加入1/10体积的醋酸钠和等体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾骥孟，蒙明慧，许晓玲，唐振洲，胡鹏，
申请(专利权)人：江苏医诺万细胞诊疗有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32