用于同时检测四种病原菌的试剂盒及其非诊断性检测方法技术

本发明专利技术公开了采用荧光定量PCR同时检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的试剂盒和非诊断性检测方法，试剂盒中包括对应四种病原菌的特异性引物和探针。本发明专利技术提供的试剂盒使用方便，所用的试剂少，成本低，检测的特异性强，灵敏度高；检测方法实现了对同一个样本，可进行四种病原菌的检测，大大简化了操作过程，减少了重复操作的步骤，节省时间，减轻重复操作消耗的劳动力，并有效节约成本，实现快速筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及同时检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的试剂盒及其非诊断性检测方法。
技术介绍
鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)为革兰染色阴性短小杆菌，是鼠疫的病原菌，动物和人间鼠疫的传播主要以鼠蚤为媒介。当鼠蚤吸取含病菌的鼠血后，细菌在蚤胃大量繁殖，当蚤再吸入血时，又将病原菌带入动物或人体内。蚤粪也含有鼠疫杆菌，可因搔痒进入皮内。此种“鼠→蚤→人”的传播方式是鼠疫的主要传播方式，少数可因直接接触病人的污染物而受染，并且肺鼠疫患者可借飞沫传播，造成人间肺鼠疫大流行。鼠疫在临床上有腺型、肺型、败血型及轻型等四型，除轻型外，各型初期的全身中毒症状大致相同。其主要的检测肝脏、肺部、淋巴组织等器官。土拉菌(Francisella tularensis)是一种革兰氏染色阴性的球杆菌，能引起的土拉菌病(tularem ia，简称土拉热或野兔热)，是一种典型的人兽共患病，该病原菌因其传播途径多样，易扩散，毒性强，土拉菌在自然界的媒介主要为节肢类动物如多种蜱类，而宿主主要包括野兔及野鼠类等。在许多疫源地内，通过蜱叮咬而感染的病例非常普遍，而近年来有关经鼠类传播感染人“野兔热”的报道日益增多，严重威胁人类的生命安全。类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)为细胞内寄生的革兰阴性杆菌，能引起的类鼻疽病是一种重要的人兽共患病疾病，由于对人或动物具有高度致病性、死亡率很高。人鼻疽的传播途径通常是经过感染材料进入皮肤擦伤或伤口引起慢性形式的疾病；但通过蓄意释放或气溶胶浓缩获得的感染常引起急性鼻疽，不及时治疗，几天内死亡且可作为潜在的生物武器，美国CDC将其列为B类生物恐怖剂。目前，类鼻疽伯克霍尔德菌引发的类鼻疽病已经成为世界性问题(Dance D，2000)，且迄尚没有可供使用的抗类鼻疽的疫苗。因此，及时、准确地做出诊断，对于提高治愈率、控制感染菌扩散和流行病学研究等，均具有重要意义。布鲁菌(Brucella)是一种革兰氏阴性、无芽孢、兼性细胞内寄生的细菌，根据抗体的变化和主要宿主把布鲁菌属的细菌分成6个种：羊种布鲁菌(B.mel itensis)、猪种布鲁菌(B.sui s)、牛种布鲁菌(B.a bortus)、犬种布鲁菌(B.cani s)、绵羊种布鲁菌(B.ovi s)、森林鼠种布鲁菌(B.neotoma e)。鲁氏菌引起的布鲁菌病是引起的世界五大人畜共患传染病之一能引起人和多种动物的急性和慢急性感染，目前已知有60多种家畜、家禽，野生动物是布鲁菌的宿主。与人类有关的传染源主要是羊、牛及猪，其次是犬和鼠。染菌动物首先在同种动物间传播，造成带菌或发病，随后波及人类被感染的人和动物表现为流产及不孕不育等症状。本病流行于世界各地(Jonas M et al，2010)据调查全世界160个国家中有123个国家有布鲁菌病发生，给人类的生命和财产带来了巨大的威胁。综上所述，鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌是四种重要人兽共患病的病原体，分布广泛、危害严重。因此建立一种同时快速检测这四种病原体的方法，在公共卫生安全、生物恐怖袭击、出入境检验检疫方面具有重要的意义。现有技术中用于单一检测病原的方法很常见，但能够实现同时检测上述四种病原的检测方法很罕见，现有专利公开号为CN101560557，公开了一种联合检测五种烈性病原菌的基因液相芯片及其非诊断性检测方法，采用基因液相芯片检测同时检测炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌、布鲁菌和类鼻疽伯克霍尔德菌五种病原体。检测过程中需要有5种编码微球与与捕获探针偶联，需要将微球洗涤，活化，操作复杂，有时偶联失败，会导致后续检测结果无效，浪费了人力物力。且采用的悬浮芯片检测系统，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色激光对表面结合的荧光染料进行识别，编码微球的试剂较贵，所用试剂EDC、链亲和素-藻红蛋白需要进口试剂，国产试剂效果不佳，仪器也不是普通的检测单位所具备的，采用血球计数器计数微球的数量时需要高倍数的微生物显微镜，检测荧光时需要悬浮芯片检测仪，所以采用基因液相芯片检测这几种病原的局限性很大，为此需要一种能同时检测这几种病原，且检测试剂容易获得，适用于现有单位均可实现检测目的的检测试剂及检测方法。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一组用于同时检测检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的核酸。本专利技术还提供一种用于荧光定量PCR同时检测检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的试剂盒及其非诊断检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一组用于多重PCR同时检测四种病原菌的核酸，包括鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的上、下游引物，其中，所述鼠疫耶尔森菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；所述土拉菌的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；所述类鼻疽伯克霍尔德菌的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示；所述布鲁菌的上游引物序列如SEQ ID No.13所示，下游引物序列如SEQ ID No.14所示。一组用于荧光定量PCR同时检测四种病原菌的核酸，包括如上所述鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的上、下游引物和各病原菌对应的探针，所述鼠疫耶尔森菌的探针序列如SEQ ID No.3所示；所述土拉菌的探针序列如SEQ ID No.7所示；所述类鼻疽伯克霍尔德菌的探针序列如SEQ ID No.11所示；所述布鲁菌的探针序列如SEQ ID No.15所示。如上所述的核酸，优选地，该组核酸还包括包含检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的阳性扩增产物序列，其中，所述检测鼠疫耶尔森菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.4所示的序列；所述检测土拉菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.8所示的序列；所述检测类鼻疽伯克霍尔德菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.12所示的序列；所述检测布鲁菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.16所示的序列。一种用于荧光定量PCR同时检测四种病原菌的试剂盒，该试剂盒包括：上述鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别对应标记FAM-BHQ1、Texred-BHQ2、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3。如上所述的试剂盒，优选地，还包括检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的阳性扩增产物序列，其中，所述检测鼠疫耶尔森菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.4所示的序列；所述检测土拉菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.8所示的序列；所述检测类鼻疽伯克霍尔德菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.12所示的序列；所述检测布鲁菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.16所示的序列。如上所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于多重PCR同时检测四种病原菌的核酸，其特征在于，包括鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的上、下游引物，其中，所述鼠疫耶尔森菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；所述土拉菌的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；所述类鼻疽伯克霍尔德菌的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示；所述布鲁菌的上游引物序列如SEQ ID No.13所示，下游引物序列如SEQ ID No.14所示。

【技术特征摘要】
1.一组用于多重PCR同时检测四种病原菌的核酸，其特征在于，包括鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的上、下游引物，其中，所述鼠疫耶尔森菌的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；所述土拉菌的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；所述类鼻疽伯克霍尔德菌的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示；所述布鲁菌的上游引物序列如SEQ ID No.13所示，下游引物序列如SEQ ID No.14所示。2.一组用于荧光定量PCR同时检测四种病原菌的核酸，其特征在于，包括如权利要求1所述鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的上、下游引物和各病原菌对应的探针，所述鼠疫耶尔森菌的探针序列如SEQ ID No.3所示；所述土拉菌的探针序列如SEQ ID No.7所示；所述类鼻疽伯克霍尔德菌的探针序列如SEQ ID No.11所示；所述布鲁菌的探针序列如SEQ ID No.15所示。3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，该组核酸还包括包含检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的阳性扩增产物序列，其中，所述检测鼠疫耶尔森菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.4所示的序列；所述检测土拉菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.8所示的序列；所述检测类鼻疽伯克霍尔德菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.12所示的序列；所述检测布鲁菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.16所示的序列。4.一种用于荧光定量PCR同时检测四种病原菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：如权利要求2所述的鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的上、下游引物和相应的探针，各条探针的5'端和3'端分别对应标记FAM-BHQ1、Texred-BHQ2、JOE-TAMRA和CY5-BHQ3。5.如权利要求4所述的试剂盒，优选地，还包括检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌的阳性扩增产物序列，其中，所述检测鼠疫耶尔森菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.4所示的序列；所述检测土拉菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.8所示的序列；所述检测类鼻疽伯克霍尔德菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.12所示的序列；所述检测布鲁菌的阳性扩增产物序列，包含如SEQ ID No.16所示的序列。6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括Premix EX TaqTM×2。7.一种用于荧光定量PCR同时检测四种病原菌的非诊断性检测方法，其特征在于，该方法用于检测鼠疫耶尔森菌、土拉菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和布鲁菌四种病原菌，具体包括以下步骤：(1)从样...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨宇，王静，张志华，吉尚志，赵婷婷，王建成，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11