基于分裂式识别模式结合级联信号放大策略检测microRNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于分裂式识别模式结合级联信号放大策略设计的检测miRNA的试剂和检测方法，所述检测miRNA的试剂包含具有粘性末端的发夹识别探针、辅助识别探针和具有G四倍体互补序列和切刻酶识别位点的锁式DNA。可以实现将目标miRNA从同源性序列中准确的区分出来，方法的选择性好，灵敏度高，方法的检测限为3.2pM。本发明专利技术还进行了血清中的加标回收实验，回收率范围为96％‑102％。结果表明，本发明专利技术的检测试剂和检测方法对于临床诊断和疾病治疗方面miRNA的检测具有较大的应用潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于分裂式识别模式结合级联信号放大策略检测microRNA的方法。
技术介绍
microRNA(miRNA)是一类内源性非编码RNA分子，具有18-24个碱基的长度，通过对靶基因mRNA进行切割或者抑制翻译调控基因的表达。此调控功能使得miRNA在许多生理学过程中发挥重要的作用，例如细胞的增殖、迁移和凋亡。最近研究表明miRNA的异常表达与癌症的引发和发展密切相关。miRNA已经被作为生物标志物用于癌症的诊断和治疗。因此，特异和灵敏的检测miRNA对于临床诊断和疾病治疗至关重要。miRNA同族成员之间具有序列相似、序列短、丰度低、易降解等特点，因此，对于miRNA的检测方法需要具备良好的特异性、灵敏度和稳定性。miRNA的传统检测方法有：实时聚合酶链式反应、微阵列技术和Northern印迹法。除此之外，还有荧光法、电化学法、比色法和生物发光法。在这些方法中，识别模式对于miRNA的特异性检测至关重要。近期报道的识别模式主要是基于直接杂交反应的识别模式和基于连接反应的识别模式。尽管这些识别模式在一定程度上提高了miRNA检测的特异性，但是仍然存在某些限制。例如：在基于直接杂交反应的识别模式中，miRNA的特异性识别是基于简单的Watson–Crick配对。但是比较小的热力学能变化使得该识别模式具有较差的特异性。在基于连接反应的识别模式中，miRNA的特异性识别是基于连接酶在完全匹配的末端通过连接反应连接探针。然而，当碱基错配的位置远离连接位点时，该识别模式不能表现出满意的特异性。粘性末端介导的链置换反应是一个可控的反应。在这个反应中，目标序列与两条杂交链中的一条的粘性末端杂交，引发链置换反应。当目标物与粘性末端互补的部分与粘性末端完全匹配时，目标物从粘性末端的解离速率比链置换的速率慢。然而，当目标物与粘性末端互补的部分存在错配时，目标物从粘性末端的解离速率比链置换的速率快，不能引发链置换反应。李课题组构建了一种基于粘性末端介导的链置换反应的识别模式用于特异性检测miRNA。与基于直接杂交反应和连接反应的识别模式相比，该识别模式具有一个额外的竞争链，因此表现出较高的特异性。然而，该识别模式在特异性检测碱基错配位置远离粘性末端的同源序列时依旧存在限制。因此，亟需发展一种能够区别碱基错配序列位于任何位置的miRNA特异识别模式。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种基于分裂式识别模式结合级联信号放大策略检测miRNA的方法。其中，分裂式识别模式的双部分识别能力使得该策略具有良好的选择性，级联信号放大的高放大效率使得该策略具有较高的灵敏度，检测限达3.2pM，对于临床诊断和疾病治疗方面具有较大的应用潜力。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种用于检测miRNA的发夹识别探针(HP)和辅助识别探针(AP)；所述发夹识别探针包括：聚合模板序列、切刻酶识别序列和miRNA识别序列I；所述辅助识别探针包括：miRNA识别序列II和引物序列；所述miRNA识别序列I和miRNA识别序列II与待检测的miRNA序列互补，用于同时识别miRNA。所述切刻酶识别序列为：5’-G CTG AGG-3’。所述引物序列为：5’-ATG GGA GTT GAG TG-3’。在本专利技术的一个具体实施方式中，提供了一种用于检测let-7b的发夹识别探针和辅助识别探针；所述发夹识别的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；具体如下：HP：5’-GGG AGT TGA GTG CTG AGG TTT TTC ACT CAA CTC CCT ACT ACC TCA-3’(SEQ ID NO.1)；(序列中，正常字体部分为聚合模板序列，加粗字体部分为切刻酶识别序列，斜体部分为miRNA识别序列I)所述辅助识别探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；具体如下：AP：5’-AAC CAC ACA ACC ATG GGA GTT GAG TG-3’(SEQ ID NO.2)；(序列中，正常字体部分为引物序列，斜体部分为miRNA识别序列II)上述发夹识别探针和辅助识别探针可以用于miRNA的识别和检测。本专利技术的第二方面，提供一种检测miRNA的试剂，包含：上述发夹识别探针(HP)、辅助识别探针(AP)和具有G四倍体互补序列和切刻酶识别位点的锁式DNA；所述锁式DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体如下：Padlock DNA：p-AGT GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GGA GTT G(SEQ ID NO.3)。(序列中，加粗字体部分为切刻酶识别序列)进一步的，所述试剂中还包含：KF聚合酶、Nt.BbvCI切刻酶、T4DNA连接酶和Phi29DNA聚合酶。本专利技术的第三方面，提供一种检测miRNA的方法，步骤如下：(1)制备不同浓度的miRNA溶液，加入发夹识别探针和辅助识别探针，恒温孵育；再加入KF聚合酶、Nt.BbvCI切刻酶和dNTPs，进行链置换放大反应；(2)向步骤(1)反应后的溶液中加入锁式DNA和T4DNA连接酶，恒温孵育，进行连接反应；再加入Nt.BbvCI切刻酶、Phi29DNA聚合酶和dNTPs，进行循环滚环放大反应；(3)向步骤(2)反应后的溶液中加入NMM和KCl，孵育，检测荧光强度，构建净荧光强度与miRNA浓度之间的线性方程，对待测样品，可通过测定样品的净荧光强度，代入线性方程，计算样品的miRNA浓度。步骤(1)中，所述恒温孵育的条件为：37℃恒温孵育1h。步骤(1)中，所述链置换放大反应的条件为：37℃恒温孵育0.5h，然后于85℃加热20min使酶失活，结束反应。步骤(2)中，所述恒温孵育的条件为：37℃恒温孵育1h。步骤(2)中，所述循环滚环放大反应的条件为：37℃下孵育1.5-4.0h，然后于75℃加热20min使酶失活，结束反应。步骤(3)中，荧光强度检测的光谱条件为：发射光谱范围为550～680nm，激发波长为399nm，激发和发射的狭缝宽度均为10nm，激发电压为700V，选择612nm处荧光发射强度为衡量标准。在本专利技术的一个具体实施方式中，步骤(3)，构建的净荧光强度与miRNA(let-7b)浓度之间的线性方程为：y＝95.4+2.96×1011X；其中，y为净荧光强度(即F-F0，F为含有miRNA的样品的荧光强度，F0为不含miRNA的样品的荧光强度)；X为miRNA浓度。上述线性方程的线性范围为10pM-10nM。本专利技术的基于分裂式识别模式结合级联信号放大策略检测miRNA的原理为：分裂式的识别模式包含两种特异性的识别过程，这两种特异性的识别过程分别是基于粘性末端介导的链置换反应和直接杂交反应。基于此，本专利技术设计了两种特异性探针，即：具有粘性末端的发夹识别探针(HP)和辅助识别探针(AP)。首先，发夹探针的粘性末端和辅助探针同时识别部分miRNA，然后进行链置换反应将发夹探针打开形成稳定的DNA Y型结构。接下来，DNA Y型结构中的辅助探针能够作为引物在KF聚合酶和dNT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测miRNA的发夹识别探针和辅助识别探针；所述发夹识别探针包括：聚合模板序列、切刻酶识别序列和miRNA识别序列I；所述辅助识别探针包括：miRNA识别序列II和引物序列；所述miRNA识别序列I和miRNA识别序列II与待检测的miRNA序列互补，用于同时识别miRNA。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测miRNA的发夹识别探针和辅助识别探针；所述发夹识别探针包括：聚合模板序列、切刻酶识别序列和miRNA识别序列I；所述辅助识别探针包括：miRNA识别序列II和引物序列；所述miRNA识别序列I和miRNA识别序列II与待检测的miRNA序列互补，用于同时识别miRNA。2.如权利要求1所述的发夹识别探针和辅助识别探针，其特征在于，所述切刻酶识别序列为：5’-G CTG AGG-3’；所述引物序列为：5’-ATG GGA GTT GAG TG-3’。3.一种用于检测let-7b的发夹识别探针和辅助识别探针，其特征在于，所述发夹识别探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述辅助识别探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种检测miRNA的试剂，其特征在于，包含：权利要求1-3任一项所述的发夹识别探针、辅助识别探针，以及具有G四倍体互补序列和切刻酶识别位点的锁式DNA；所述锁式DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.如权利要求1所述的检测miRNA的试剂，其特征在于，所述试剂中还包含：KF聚合酶、Nt.BbvCI切刻酶、T4 DNA连接酶和Phi29 DNA聚合酶。6.一种利用权利要求4或5所述的试剂检测miRNA的方法，其特征在于，步骤如下：(1)制备不同浓度的miRNA溶液，加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜玮，王磊，王瑞，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37