本发明专利技术提供一种集信号放大和信号报告为一体的寡核苷酸探针。探针是一对基于靶分子设计的具有粘性末端的DNA发夹序列，实质是杂交链式反应燃料分子和G-四链体序列相结合的产物，既具有杂交链式反应可通过无酶、等温的方式将靶分子信号级联放大的特点，又可通过G-四链体序列这一信号报告元件的引入使得放大后的靶分子信号以方便、简捷的方式得以检测。本发明专利技术还提供了由上述探针介导的无酶等温核酸探针方法，可使待检测物的信号在没有任何酶参与且于常温条件下便可得到放大和检测，方法灵敏准确、简便易行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸探针技术，具体涉及一种集信号放大和信号报告为一体的寡核苷酸探针以及一种由该探针介导的无酶等温核酸探针技术来对靶分子进行检测的方法。
技术介绍
核酸探针是能与靶分子特异结合且能将靶分子信号转换为可供后续检测的信号的核酸分子，运用核酸探针对靶分子进行检测分析的技术即为核酸探针技术。核酸探针技术是实现核酸定性和定量分析的有力工具，目前广泛应用于疾病诊断和预防、临床微生物学、群体遗传学、法医学、食品安全等领域。对于极微量的核酸靶分子，为了提高检测灵敏度，通常需对靶分子信号进行放大从而进行检测。常用的信号放大技术包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、 滚环复制放大技术(RCA)等方法，但这些方法都需要价格昂贵的酶制剂参与。2004年，R. M. Dirks和N. A. Pierce首次报道了无需酶参与且等温条件下即可反应的信号放大技术——杂交链式反应(HCR)。基本的杂交链式反应体系的核心部件为一对含粘性末端的发夹序列，又称为燃料分子。第一个发夹的粘性末端和相邻的茎部序列可与靶分子特异结合，剩余部分与第二个发夹的粘性末端和相邻的茎部序列互补，而第二个发夹除去与第一个发夹互补的序列，剩余部分又与靶分子具有相同的作用，均能与第一个发夹特异结合。当反应体系中不存在靶分子时，发夹序列保持亚稳态的发夹结构。当反应体系中存在祀分子时，祀分子便可与第一个发夹序列杂交，破坏其二级结构并释放剩余序列；随后，第一个发夹被释放的序列可与第二个发夹杂交，破坏第二个发夹并释放出与靶分子具有相同作用的核酸序列，如此周而复始，最终形成类似双链DNA的大分子聚合物，从而达到无酶、等温放大靶分子信号的目的。放大后的信号可通过琼脂糖凝胶电泳或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳呈现出来。杂交链式反应对能直接或间接使体系中燃料分子发生聚合的靶分子均具有较好的放大作用。为了对靶分子进行更快速、直接、准确的检测，使杂交链式反应中的燃料分子真正成为一种集信号放大和信号报告为一体的核酸探针，还需赋予燃料分子合适的信号报告方式。Pierce团队将纳米金颗粒引入杂交链式反应，实现了对靶分子的可视化检测。2007年，D. A. Chemeris等在HCR体系的发夹序列中引入荧光基团和淬灭基团，通过杂交链式反应对待检测物进行适时的荧光定量检测。2010年，谭蔚泓等将荧光染料芘引入HCR发夹序列的粘性末端，利用染料分子的空间特性，使其在有靶分子存在时产生荧光信号，反之则不产生荧光信号。同年，张书圣等通过生物素修饰和磁珠固定技术将杂交链式反应与辣根过氧化物酶(HRP)相结合，使放大后的信号可通过荧光进行检测。这几种方法均通过对杂交链式反应体系中燃料分子进行修饰来实现放大后的靶分子信号的检测，价格昂贵，操作复杂，且对仪器具有绝对的依赖性。所以，寻找一种简单、易行的信号报告方式使HCR检测更快速、简便、经济具有重要意义。G-四链体是一段富含鸟嘌呤(G)的高度有序的DNA或RNA序列。一定溶液环境中，鸟嘌呤(G)可通过hoogsteen氢键折叠形成G-四链体平面,连续的G-四链体平面的堆积便可形成稳定的G-四链体空间二级结构。G-四链体序列多存在于真核生物的端粒中，也存在于其它的非端粒基因组DNA中，如核酸酶敏感的启动子序列中。1996年，Dipankar Sen等首次通过体外筛选(SELEX)技术获得能与卟啉化合物特异识别的G-四链体序列(PS5. M和PS2. M)，随后又发现这类G-四链体序列可与hemin特异结合并显示出非常强的过氧化物酶活性，可催化H2O2氧化ABTS2_产生有颜色的自由基ABTS‘+，使溶液呈肉眼可见的蓝绿色。至此，G-四链体成为一种新的脱氧核酶(DNAzyme, Catalytic DNA, Deoxyribozyme)。除能与hemin特异结合外，G-四链体还可与多种卟啉类化合物结合，TaoLi等首次报道了 G-四链体与ZnPPIX的相互作用关系，其研究表明受试的G-四链体PW17、PS2. M以及T30695均可与ZnPPIX相互作用产生明显的荧光信号。基于杂交链式反应和G-四链体，本专利技术的目的便是将这两者有机结合，提供一种集靶分子信号逐级放大和信号报告为一体的核酸探针以及利用该探针对靶分子信号进行简单快速的定性定量分析的无酶、等温检测技术
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种集祀分子信号逐级放大和信号报告为一体的核酸探针以及利用该探针对靶分子信号进行简单快速的定性定量分析的无酶、等温检测方法。本专利技术的技术方案如下本专利技术的第一方面，提供了一种集信号放大和信号报告为一体的寡核苷酸探针。探针的基本骨架与传统杂交链式反应燃料分子的骨架一致，是一对具有粘性末端的DNA发夹序列，不同之处在于信号报告元件G-四链体序列的引入。该发夹序列由普通的单链寡核苷酸序列通过内部碱基互补结合形成，均由粘性末端、茎部和环部组成。该发夹对的第一个发夹具有靶分子特异识别和结合能力，其二级结构在靶分子存在条件下可被打开。该发夹对间具有交互互补的特点，在靶分子打开任意第一个发夹的二级结构后，剩余的发夹对可通过杂交互补相继打开，最终形成类似DNA双链的长链聚合分子。 该发夹序列的茎部是由一寡核苷酸序列中两段互补的碱基序列通过氢键结合回折形成的DNA双链区域，环部则为上述两段互补序列之间的一段DNA单链区域。第一个发夹序列的粘性末端位于5’ -端，第二个发夹序列的粘性末端位于3’ -端。本专利技术所述探针的结构及各部分作用和相互关系为(I)第一个发夹序列粘性末端位于整个发夹结构的5’ -端。紧邻粘性末端的茎部序列主要由两部分组成①靠近粘性末端一侧的部分茎部序列。该序列与粘性末端共同构成靶分子的特异识别序列；②靠近环部的部分茎部序列。此为G-四链体5’ -端部分序列，为被封闭在茎部的一小段G-四链体序列，使G-四链体序列在无靶分子存在时不显示活性。与被封闭的G-四链体序列3’ -端一侧相接的是环部序列，主要由G-四链体序列的剩余部分组成。环的3’ -端一侧茎部序列与环的5’ -端一侧茎部序列几乎完全互补，除在靶分子特异识别序列近3’ -端处有一个碱基与另一侧茎部序列的相应碱基不配对。视G-四链体序列不同，在不影响G-四链体二级结构及其活性的前提下，序列前后可添加不同数量的任意碱基，保证释放后的G-四链体序列有足够的空间形成二级结构。(2)第二个发夹序列粘性末端位于整个发夹序列的3’ -端，与相邻的茎部序列共同组成第一个发夹序列环部3’ -端一侧茎部序列的互补序列。环部为第一个发夹序列5’ -粘性末端的互补序列，与相邻的5’ -端一侧的茎部序列共同组成第一个发夹序列中靶分子特异识别序列的互补序列，该部分序列具有与靶分子相同的作用，均能与第一个发夹序列的靶分子特异识别序列特异结合。该探针的第一个发夹序列的靶分子特异识别序列与被封闭的信号报告元件序列结合处附近含有至少一个碱基与茎部另一侧序列的相应碱基不配对。本专利技术的探针结构如附图I所示。 本专利技术所涉及的G-四链体是一段富含鸟嘌呤(G)且在一定溶液环境下能形成G-四链体二级结构的DNA序列，能与卩卜啉铁(hemin)等结合产生过氧化物酶活性。在含G-四链体的反应体系中加入hemin、显色底物(ABTS、D本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种集信号放大和信号报告为一体的寡核苷酸探针，其特征在于，所述探针为一对基于靶分子设计的具有粘性末端的DNA发夹序列，其由一条普通的单链寡核苷酸序列通过内部碱基互补结合形成的，均由粘性末端、茎部和环部组成；第一个发夹序列的粘性末端位于5’？端，第二个发夹序列的粘性末端位于3’？端。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐卓，董娟，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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