本发明专利技术提供目标物保护的哑铃分子探针介导的级联滚环扩增策略用于DNA甲基转移酶活性的灵敏检测，基于目标物保护的哑铃分子探针介导的级联的滚环扩增策略，我们开发了一种新颖的DNA甲基转移酶活性分析的荧光检测系统。该检测体系具有出色的特异性和灵敏性，检测限低至0.0024U/mL，在定量监测甲基转移酶活性和抗癌药物的筛选中表现出潜在的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶活性检测领域，具体涉及一种目标物保护的哑铃分子探针介导的级 联的滚环扩增策略检测DNA甲基转移酶活性的方法、探针和试剂盒。
技术介绍
DNA甲基转移酶的功能是维持基因组的甲基化模式，在调控基因表达和维持基因 组稳定性中发挥着重要的作用。甲基转移酶活性的异常会导致异常的DNA甲基化模式，从 而使得肿瘤抑制基因沉默并导致癌症的发生。因此DNA甲基转移酶的活性已经成为许多癌 症的预测标志物和治疗靶点。此外，甲基转移酶活性的异常通常发生在其他恶性肿瘤迹象 之前，因此在癌症的早期诊断中具有潜在的应用价值。因此，准确和灵敏的甲基转移酶活性 分析和抑制剂的筛选用于活性抑制为临床诊断和药物开发提供了一种有价值的策略。 检测DNA甲基转移酶活性的传统的方法包括辐射标记法，高效液相色谱法，凝胶 电泳法和基于免疫的分析方法。除了这些方法，一些新颖的具有提高的检测灵敏度，特异性 和简便性的策略也已经被报道，包括荧光法，比色法，生物发光法，化学发光法，电化学和电 致化学发光法。在大多数的这些新颖的方法中，DNA分子探针由于具有独特的分子识别能 力和设计的灵活性而在目标物识别和信号扩增中起到了重要的作用。首先，DNA分子探针 被赋予了DNA甲基转移酶和甲基化敏感的限制性内切酶的双识别功能，用于区分甲基化的 和未甲基化的DNA分子探针。此外，DNA分子探针中也含有能够介导扩增策略的DNA触发 链序列用于放大区分事件。目前，大多数已报道的用于DNA甲基转移酶活性分析的DNA分 子探针都是双链DNA或发夹DNA。在DNA甲基转移酶和内切酶作用之后，DNA触发链被释放 或完整的DNA探针被保留来放大甲基化事件。尽管这些方法实现了灵敏的DNA甲基转移酶 的活性分析，但是仍然存在一些影响检测准确性和灵敏性的局限。双链DNA或发夹DNA中 的DNA触发链处于半封闭的状态，因此DNA分子探针和后续的信号扩增探针的杂交或放大 体系中探针和核酸酶的非特异性的作用可能导致非特异性的扩增。此外，通常也需要其他 的DNA探针（如挂锁探针，发夹探针或标记的信号探针）来将识别事件转导为放大的信号 的输出，而这种间接的检测模式会导致灵敏度的降低和复杂的探针设计。
技术实现思路
鉴于以上的局限性，本文中我们基于目标物保护的哑铃分子探针（D-probe)介导 的级联的滚环扩增策略开发了一种准确、灵敏的DNA甲基转移酶活性分析方法（图1)。首 先D-probe作为甲基转移酶和内切酶的酶联识别探针。随后，甲基化保护的D-probe保留 完整性并可作为级联的滚环扩增的环状模板。最后，级联的滚环扩增产生大量的D-probe 复制体，这些复制体能够与多分子标记的SybrGreenI染料结合，产生协同放大的焚光信 号用于检测。与已报道的基于双链或发夹DNA分子探针相比，该方法具有以下的特点：（1) D-probe同时作为DNA甲基转移酶和内切酶的识别探针，级联的滚环扩增的模板和信号探 针避免了多个探针设计的需要。（2) -旦未甲基化的D-prone被内切酶切为两部分，级联的 滚环扩增能够被有效的阻止，因此降低了非特性的扩增。（3)级联的滚环扩增和多分子标记 的SybrGreenI的协同放大作用能够保证甲基转移酶活性分析的灵敏度的提高。（4)DNA 甲基转移酶和内切酶的酶联识别之后，D-probe能够被级联的滚环扩增过程直接的放大。这 种更直接的检测模式会带来更简单和灵敏的甲基转移酶活性的分析。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： -种用于检测DNA甲基转移酶活性或抑制剂药物的筛选的哑铃分子探针，该探针 颈部含有能被甲基转移酶和对甲基化敏感的限制性内切酶识别的5'-CCGG_3'序列，该探针 环部含有能够介导级联的滚环扩增的DNA触发的5-CCGG-3'的四核苷酸序列。 优选的，所述探针序列为SEQIDNO: 1所示： SEQIDNO: 1: p-CCGGTTCCTCTCTTAGTGCAGAGTACGGAGATAGGGAGAAAGGAGAGGAACCGG GTGTGTGTAAAGAAAGAAAGAAAGACACACAC〇 本专利技术的上述的探针可用于检测甲基转移酶活性或抑制剂药物的筛选。 本专利技术还提供了一种检测甲基转移酶活性的方法，根据上述探针发生甲基化与 否，以及能否进而被对甲基化敏感的限制性内切酶剪切从而发生随后的级联的滚环复制和 荧光染色来判断甲基转移酶的活性。 优选的，具体包括如下步骤： 1)设计权利要求1或2所述的探针； 2)将甲基化转移酶、限制性内切酶同时作用于该探针； 3)将得到的产物进行级联滚环扩增； 4)向级联滚环扩增产物中加入相应的荧光染料，检测信号强度，根据信号强度和 甲基转移酶活性的对应关系判定待测甲基转移酶的活性。 优选的，所述步骤2)的具体作用过程为： 若甲基转移酶不存在时，所述探针的5'-CCGG_3'的序列能够被对甲基化敏感的限 制性内切酶识别，并在胞嘧啶之间切割为两部分；随后的级联的滚环扩增过程被阻止；若 甲基转移酶存在时，该探针的5' -CCGG-3'的序列中的胞嘧啶被甲基化，形成5' -CCmGG-3' 的序列对甲基化敏感的限制性内切酶的切割被阻止，随后进行级联的滚环扩增。 优选的，所述级联滚环扩增的具体步骤为：将步骤2)得到的甲基化保护的完整的 D-probe与引物1--P1杂交，并在phi29DNA聚合酶的作用下进行线性的滚环扩增，形成 长的重复的D-probe的复制体；然后，引物2--P2被加入沿着RCA的产物形成多重的双链 片段，形成的双链片段被Rsal识别并切割，使得长的RCA产物转化为多个新的D-probe单 体；随后，对Rsal进行热失活，使得碎片P2从新的D-probe单体上解离下来，完整的P2与 新的D-probe单体杂交；再然后，新形成的多个环状的D-probe单体和P2触发新一轮的滚 环扩增，产生更多的D-probe复制体； 其中，所述的Rsal能够识别和切割双链回文序列5' -GT丨AC-3'，丨代表切割位 点。 更优选的，所述引物1序列为SEQIDN0:2所示， SEQIDNO:2 ： CTCCCTATCTCCGTACTCTGCA。 更优选的，所述引物2序列为SEQIDNO:3所示： SEQIDNO:3 ： TGCAGAGTACGGAGATAGGGAG〇 本专利技术还提供了一种用于检测甲基转移酶活性或抑制剂药物的筛选的试剂盒，所 述试剂盒包括上述的任意一项探针。 本专利技术的有益效果： 总而言之，我们已经开发了一种目标物保护的哑铃分子探针介导的级联的滚环扩 增策略用于准确和灵敏的DNA甲基转移酶活性的分析。Hpall充分的切割和级联的滚环扩 增对环状模板的依赖性提高了扩增的特异性。级联的滚环扩增和多分子标记的SybrGreen I的引入提高了检测的灵敏度。多功能化的哑铃分子探针的设计避免了复杂的探针设计。 通过该策略获得了宽的动力学范围（0. 01到50U/mL)和低的检出限（0. 0024U/mL)。我们也 证实了该策略在含有细胞裂解液的样品中工作的有效性。更重要的是，利用该方法也能便 利的评估5-Aza-dC和5-Aza的抑制效应，从而在定量监测和甲基转移酶活性和抑制剂药物 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测DNA甲基转移酶活性或抑制剂药物的筛选的哑铃分子探针，其特征在于，该探针颈部含有能被甲基转移酶和对甲基化敏感的限制性内切酶识别的5’‑CCGG‑3’序列，该探针环部含有能够介导级联的滚环扩增的DNA触发的5‑CCGG‑3’的四核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜玮，王磊，赵海燕，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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