本发明专利技术公开了用于孔石莼LAMP-LFD检测的引物和探针序列，特点是根据基因库登录号为HQ902008的孔石莼内转录间隔区序列的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-6所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，利用上述的引物和探针，通过LAMP反应体系扩增步骤，探针杂交LAMP反应产物步骤，使用LFD检测步骤实现孔石莼的检测，优点是检测速度快，检测成本低，检测灵敏度和准确性高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测孔石莼的引物和探针序列，尤其是涉及一种用于孔石莼 LAMP-LFD检测的引物和探针序列。
技术介绍
孔石药（ZZ/rapertofa)属于绿藻纲，石药目，石药科，石药属。石药属（ZZ/ra)藻 类呈全球性分布，多数种类生活在温带至亚热带海洋中，部分生长在高潮带至低潮带和大 干潮线附近岩石上或石沼中。石莼属藻类富含蛋白和多种微量元素，具有很高的食用及药 用价值。作为重要的经济藻类，孔石药（KjOeriiAsa)、消1苔（ZZ/ra 等已得到越 来越多的开发利用。然而，当石莼属藻类脱离固着基，形成大量的漂浮增殖群体时，将导致 绿潮的爆发，破坏底栖生态系统。自20世纪70年代初法国布列塔尼沿海首次报道以来，绿 潮发生范围已遍及欧洲沿海、美国东西海岸、东亚和东南亚沿海以及澳大利亚等国，成为世 界性的海洋环境问题。因此，建立快速、准确、灵敏的检测孔石莼的新方法，对于绿潮的早期 判断和预警、实时监测及防治具有重要的意义。 长期以来，石莼属等绿潮藻的分类鉴定主要依赖于显微镜下的形态学观察，通常 以其形态、结构特征等作为主要的分类依据。然而，石莼属藻类在生长时期其形态和细胞结 构上有着很好的可塑性，会随着季节和环境的变化而变化，导致形态学分类比较困难。因 此，有学者试图将以PCR为代表的分子生物学技术引入到绿潮藻类的检测中，以期对传统 分类方法加以辅助。其中，rDNA-ITS序列、rDNA-18s序列、二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基 因（rbcL)等因其种间较大的差异性，通常用作鉴定的靶标，应用于藻类的系统分类和鉴定 过程。然而，PCR技术对仪器依赖性高，需要在特定环境下由专业人员操作，只适合在实验 室开展。 环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是 2000 年 发展起来的一种新的核酸扩增方法。相对于仅需设计1对上下游引物以扩展的传统PCR法， 该方法需针对一段靶序列的不同区域设计2-3对引物，这些引物在反应过程中需完全与靶 序列匹配才能完成扩增反应。因此，LAMP具有高特异性和高灵敏度。LAMP反应在恒温条件 下进行，无需反复的升降温以使模板解链，一定程度上缩短了检测时间。此外，该技术对仪 器设备要求低，仅一台恒温水浴锅或金属浴即可满足反应条件。因而，自该技术专利技术以来已 广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原检测中。但是，LAMP产物的检测以琼脂糖凝胶电泳法 或浊度检测为主，在这点其仍然无法摆脱凝胶成像系统或浊度仪。LAMP-LFD技术以LAMP反 应为基础，随后将生物素标记的LAMP产物与异硫氰酸荧光素标记的特异性探针进行杂交， 最终在横向流动试纸条上完成检测并进行结果判定。相较于之前的LAMP产物检测方法， LFD便携性较好，且能够避免非特异性扩增而出现的假阳性。目前，该技术已成功运用于传 染性脾肾坏死病毒（//LfeciioiA? Ki/m^ISKNV)、传染性肌肉 坏死病毒κ/τ?Λ?，IMNV)、创伤弧菌以及 海豚链球菌（5'^6>/76^〇1?〇1?1^61/^ (36〇等水产病原微生物的检测，国内外还未见报道将该技 术应用于孔石莼的诊断和检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测成本低，检测灵敏度和 准确性高的用于孔石莼LAMP-LFD检测的引物和探针序列。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于孔石莼LAMP-LFD检测 的引物和探针序列，根据基因库登录号为HQ902008的孔石莼内转录间隔区序列的编码序 列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下： UpeITS-F3 :5' -TAGCCTCACCTGAACTCAG-3' UpeITS-B3 :5' -ACGGATATCTCGGCTCTC-3'， UpelTS-FIP:5' -CGGCTGAAATACAGAGGCTCGTATCCTTCGTGGCTCACA-3'， UpelTS-BIP:5' -GTTATTCCGACGCTGAGGCAGCAGAATTCCGTGAGTCAT-3'， UpeITS-LF:5' -TAGGTAGCTCGCTACTCCTAC-3'， UpeITS-LB:5' -GTGGTCTCATCCGAAGACTC-3'，UpelTS-FIP的 5' 端为生物素标记； 探针序列如下： UpeITS-ΗΡ:5' -GCAAGCGCGTGAGGGGTTAT-3'，5' 端为异硫氰酸荧光素标记。 引物工作的LAMP反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为：外引物UpeITS-F3 和UpeITS-B3 各 0· 2Mmol/L，内引物UpelTS-FIP和UpelTS-BIP各 1. 6Mmol/L，环引物 UpeITS-LF和UpeITS-LB各0.4Mmol/L，dNTPs1.4mmol/L，pH8.8 的Tris-HCl20mmol/L， KC1 10mmol/L，MgS04 6 . 5mmol/L，（NH4)2S04 10mmol/L，TritonX-100 0· 1%，8UBstDNA聚 合酶大片段和2μL样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25μL。LAMP反应条件：将上述反应体系进行扩增反应，扩增反应温度为63°C，扩增反应 时间为50min。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于 1、检测灵敏度高，对孔石莼基因组的检测灵敏度为3. 04X10 2pg/μL，是常规PCR检测 的1000倍。 2、检测时间短，扩增反应只需50min，从核酸扩增开始到完成结果判断，整个流程 仅需60min，比常规PCR检测技术缩短约1. 5h。 3、特异性强，所用的特异性引物根据孔石莼内转录间隔区中的八个不同区域设 计，并且还有DNA的特异性探针，可有效避免利用琼脂糖凝胶电泳、荧光染料等方法引起的 假阳性问题。 4、仪器设备要求低，无需常规PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统等，只需一 个水浴锅即可完成检测。 5、操作简单，结果明显，整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，稍具分子生物学基 础的人员即可完成操作；检测结果清晰明显，肉眼观察即可判断。 6、对人身和环境更加安全，检测过程中不涉及EB等有毒试剂。 综上所述，使用本专利技术的引物和探针采用LAMP-LFD方法对孔石莼进行检测，具有 更高的快捷性、特异性和灵敏度，仪器需求简单，有利于孔石莼的早期诊断和检测，可满足 基层检测机构的需要。【附图说明】 图 1 为LAMP特异性实验结果。Μ: 100bpPlusDNAladder(Fermentas,美国）； Upe:以孔石药S66 的基因组DNA为模板；Ufl、Uli、Uoh、Upr、Ata、Gin、Hak、Pdo、Str:分别 以曲浒苔SDF12、缘管浒苔HS42、FJ4、浒苔XS5、塔玛亚历山大藻NMBjah048、无 纹环沟藻NMBjah046、赤潮异弯藻H1、东海原甲藻NMBjah045、锥状斯克里普藻NMBjah044的 基因组DNA为模板；NC:以无菌去离子水作为模板； 图2为LAMP-LFD特异性实验结果。Upe:以孔石莼S66的基因组DNA为模板；Ufl、Uli、Uoh、Up本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于孔石莼LAMP‑LFD检测的引物和探针序列，其特征在于根据基因库登录号为HQ902008的孔石莼内转录间隔区序列的编码序列设计LAMP的三对引物序列和一条探针序列，引物序列具体如下：UpeITS‑F3：5’‑ TAGCCTCACCTGAACTCAG‑3’UpeITS‑B3：5’‑ ACGGATATCTCGGCTCTC‑3’，UpeITS‑FIP：5’‑ CGGCTGAAATACAGAGGCTCGTATCCTTCGTGGCTCACA‑3’，UpeITS‑BIP：5’‑ GTTATTCCGACGCTGAGGCAGCAGAATTCCGTGAGTCAT‑3’，UpeITS‑LF：5’‑ TAGGTAGCTCGCTACTCCTAC‑3’，UpeITS‑LB：5’‑ GTGGTCTCATCCGAAGACTC‑3’， UpeITS‑FIP的5’端为生物素标记；探针序列如下：UpeITS‑HP：5’‑GCAAGCGCGTGAGGGGTTAT‑3’，5’端为异硫氰酸荧光素标记。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈炯，周前进，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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