七种不同种属来源细胞的PCR检测引物和检测方法与应用技术

本发明专利技术公开了对实验室常用的七种不同种属来源的细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)的PCR检测引物和检测方法与应用。本发明专利技术的检测引物包括7对引物，且各引物仅对各自种属细胞的细胞色素b(Cytb)基因片段有特异性扩增，因此，用本发明专利技术的引物可以一次性对7种种属来源的细胞进行检测，具有较高的特异性，不仅可以对实验室常用细胞的种属来源(即细胞来源的可靠性)进行鉴定，还可以对培养过程中是否存在不同种属间细胞的交叉污染进行判定，对细胞培养以及后续实验的顺利进行提供科学依据。本发明专利技术具有特异性强、灵敏度高、快速、简便的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞检测领域，特别是涉及实验室常用的七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)的PCR检测引物和检测方法，适用于细胞来源的鉴定及细胞间交叉污染的检测。
技术介绍
体外培养的动物细胞是目前医学与生命科学领域应用最为广泛、最重要的实验工具之一，确定细胞来源的可靠性以及培养过程中是否存在不同种属间细胞的交叉污染，对于实验成功至关重要。目前，实验室常用的检测方法主要有染色体分析、STR分析、同工酶图谱分析法，这些方法成本较高、费时费力，并且可鉴定的种属范围较窄。针对这些情况，后续又开发出了PCR检测方法。与传统方法比较，PCR检测方法具有快速、简便、灵敏度高、检测范围宽等特点，并且细胞使用量小，利于在实验室中广泛使用。在PCR检测方法中，常选用线粒体DNA(mtDNA)作为目的基因。线粒体DNA是动物体内唯一存在的核内遗传信息载体，为共价闭合的双链环状分子，大多数脊椎动物的线粒体DNA约为16kb，包括由37个基因组成的编码区和一段长度可变的非编码序列(又称控制区或D-loop)，37个基因中包括2个rRNA基因(12SrRNA和16SrRNA)，22个tRNA基因和13个蛋白质基因。线粒体基因分子量小、结构简单，并且种属间特异性高、进化速度快、严格遵守母性遗传。
技术实现思路
本专利技术目的在于对实验室常用的七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)的Cytb基因设计特异性引物并建立PCR检测方法，用以检测细胞来源是否可靠，以及鉴别培养过程中细胞是否存在交叉污染。本专利技术所提供的用于对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)进行PCR检测的引物，其序列如下(见表1)：1)用于检测来源于牛的MDBK细胞(牛肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列1所示，其下游引物如序列表中序列2所示；2)用于检测来源于狗的MDCK细胞(狗肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列3所示，其下游引物如序列表中序列4所示；3)用于检测来源于仓鼠的BHK21细胞(仓鼠肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列5所示，其下游引物如序列表中序列6所示；4)用于检测来源于猪的ST细胞(猪睾丸细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列7所示，其下游引物如序列表中序列8所示；5)用于检测来源于鼠的SP20细胞(小鼠骨髓瘤细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列9所示，其下游引物如序列表中序列10所示；6)用于检测来源于人的293细胞(人肾上皮细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列11所示，其下游引物如序列表中序列12所示；和/或7)用于检测来源于非洲绿猴的VERO细胞(猴肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列13所示，其下游引物如序列表中序列14所示。本专利技术所提供的用上述引物对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)进行PCR检测的方法，可包括以下步骤：1)提取待测细胞的基因组DNA；2)以待测细胞的基因组DNA为模板，用上述7对引物分别进行PCR扩增，PCR反应体系为(25μL)：2×Dream TaqTM Green PCR Master Mix(Thermo公司)12.5μL，DNA模板(10ng/μL)2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，H2O 9.5μL；PCR反应程序为：先95℃预变性5min；然后95℃变形30s，退火(退火温度见表1)30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃完全延伸10min；3)PCR反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，上样量均为10μL，若出现932bp(序列表中序列15)的目的条带，则待测细胞中含有来源于牛的MDBK细胞；若出现439bp(序列表中序列16)的目的条带，则待测细胞中含有来源于狗的MDCK细胞；若出现198bp(序列表中序列17)的目的条带，则待测细胞中含有来源于仓鼠的BHK21细胞；若出现780bp(序列表中序列18)的目的条带，则待测细胞中含有来源于猪的ST细胞；若出现839bp(序列表中序列19)的目的条带，则待测细胞中含有来源于鼠的SP20细胞；若出现689bp(序列表中序列20)的目的条带，则待测细胞中含有来源于人的293细胞；若出现390bp(序列表中序列21)的目的条带，则待测细胞中含有来源于非洲绿猴的VERO细胞。在上述检测方法中，所述步骤2)中用于检测牛源MDBK细胞的退火温度为55℃；用于检测狗源MDCK的退火温度为60℃；用于检测仓鼠源BHK21细胞的退火温度为60℃；用于检测猪源ST细胞的退火温度为65℃；用于检测鼠源SP20细胞的退火温度为55℃；用于检测人源293细胞的退火温度为58℃；用于检测非洲绿猴源VERO细胞的退火温度为60℃。本专利技术还进一步提供鉴别细胞污染与否的方法，用前述方法对待测细胞分别进行针对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)DNA的PCR检测，依据所出现的目的条带进行以下鉴别：仅出现用待测细胞检测引物扩增所对应的目的条带，不出现用其它细胞检测引物扩增的目的条带，判定待测物细胞无污染；和出现用待测细胞检测引物扩增所对应的目的条带，同时出现用其它细胞检测引物扩增的目的条带，判定待测物细胞被其它细胞污染，且出现目的条带的对应细胞为污染细胞。或出现用待测细胞检测引物扩增所对应的目的条带，同时微弱出现用其它细胞检测引物扩增的目的条带，判定待测物细胞可能被其它细胞污染，且出现微弱目的条带的对应细胞为可疑细胞。本专利技术还提供一种用于对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)进行PCR检测的试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒包括上述用于对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)进行PCR检测的引物。本专利技术所提供的试剂盒还包括用于25μL PCR反应体系的试剂，包括：2×Dream TaqTM Green PCR Master Mix(Thermo公司)12.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，H2O 9.5μL。本专利技术针对实验室常用的七种不同种属来源的细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)提供了PCR检测引物和检测方法。本专利技术的检测引物包括7对引物，且各引物仅对各自种属细胞的细胞色素b(Cytb)基因片段有特异性扩增，因此，用本专利技术的引物可以一次性对7种种属来源的细胞进行检测，具有较高的特异性，不仅可以对实验室常用细胞的种属来源(即细胞来源的可靠性)进行鉴定，还可以对培养过程中是否存在不同种属间细胞的交叉污染进行判定，对细胞培养以及后续实验的顺利进行提供科学依据。本专利技术具有特异性强、灵敏度高、快速、简便的优点，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。附图说明图1为7种引物对PCR产物的电泳图；图2为牛源引物对(C-F和C-R)对牛源MDBK细胞的特异性检测结果；图3为狗源引物对(D-F和D-R)对狗源MDCK细胞的特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)进行PCR检测的引物，其序列如下：1)用于检测来源于牛的MDBK细胞(牛肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列1所示，其下游引物如序列表中序列2所示；2)用于检测来源于狗的MDCK细胞(狗肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列3所示，其下游引物如序列表中序列4所示；3)用于检测来源于仓鼠的BHK21细胞(仓鼠肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列5所示，其下游引物如序列表中序列6所示；4)用于检测来源于猪的ST细胞(猪睾丸细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列7所示，其下游引物如序列表中序列8所示；5)用于检测来源于鼠的SP20细胞(小鼠骨髓瘤细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列9所示，其下游引物如序列表中序列10所示；6)用于检测来源于人的293细胞(人肾上皮细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列11所示，其下游引物如序列表中序列12所示；和/或7)用于检测来源于非洲绿猴的VERO细胞(猴肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列13所示，其下游引物如序列表中序列14所示。

【技术特征摘要】
2016.07.19 CN 20161057577461.用于对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)进行PCR检测的引物，其序列如下：1)用于检测来源于牛的MDBK细胞(牛肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列1所示，其下游引物如序列表中序列2所示；2)用于检测来源于狗的MDCK细胞(狗肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列3所示，其下游引物如序列表中序列4所示；3)用于检测来源于仓鼠的BHK21细胞(仓鼠肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列5所示，其下游引物如序列表中序列6所示；4)用于检测来源于猪的ST细胞(猪睾丸细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列7所示，其下游引物如序列表中序列8所示；5)用于检测来源于鼠的SP20细胞(小鼠骨髓瘤细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列9所示，其下游引物如序列表中序列10所示；6)用于检测来源于人的293细胞(人肾上皮细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列11所示，其下游引物如序列表中序列12所示；和/或7)用于检测来源于非洲绿猴的VERO细胞(猴肾细胞)的引物，其上游引物如序列表中序列13所示，其下游引物如序列表中序列14所示。2.对七种不同种属来源细胞(MDBK、MDCK、BHK21、ST、SP20、293、VERO)进行PCR检测的方法，包括以下步骤：1)提取待测细胞的基因组DNA；2)以待测细胞的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的七对引物分别进行PCR扩增，PCR反应体系为(25μL)：2×Dream TaqTM Green PCR Master Mix(Thermo公司)12.5μL，DNA模板(10ng/μL)2μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，H2O 9.5μL；PCR反应程序为：先95℃预变性5min；然后95℃变形30s，退火(退火温度见表1)30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃完全延伸10min；3)PCR反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，上样量均为10μL，若出现932bp(序列表中序列15)的目的条带，则待测细胞中含有来源于牛的MDBK细胞；若出现439bp(序列表中序列16)的目的条带，则待测细胞中含有来源于狗的MDCK细胞；若出现198bp(序列表中序列17)的目的条带，则待测细胞中含有来源于仓鼠的BHK21细胞；若出现780bp(序列表中序列18)的目的条带，则待测细胞中含有来源于猪的ST细胞；若出现839bp(序列表中序列19)的目的条带，则待测细胞中含有来源于鼠的...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩志玲，郝鹏，陈光达，商晓桂，闫聪，陈君彦，张贵刚，范秀丽，刘国英，魏学峰，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15