一种来源于围产期胎盘血高杀伤K562细胞的CD3+CD56+细胞的制备方法技术

本发明专利技术提出了一种来源于围产期胎盘血高杀伤K562细胞的CD3+CD56+细胞的制备方法，从围产期胎盘血中分离单个核细胞以诱导分化形成CD3+CD56+细胞。采用本发明专利技术可以缩短细胞的制备周期，同时提高细胞的增殖能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞培养和免疫疗法，尤其涉及一种高杀伤K562细胞的⑶3+CD56+细胞的制备方法。
技术介绍
⑶3+CD56+细胞是一种在体外利用多种细胞因子诱导的免疫细胞。由人血液中的单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得。由于该种细胞同时表达⑶3+ (⑶3+为T细胞表面特异性蛋白，仅存在于T细胞表面)和⑶56+ (⑶56+为NK细胞表面特异性蛋白)两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞(natural killer cell,自然杀伤细胞)样T淋巴细胞(N KT细胞)，兼具T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC(major histocompatibility complex主要组织相容性复合体)限制性杀瘤优点。相对于LAK细胞(lymphokine activated killer cells,淋巴因子激活的杀伤细胞)以及CTL细胞(cytotoxic T-1ymphocyte cells,细胞毒性T淋巴细胞),其表现出更强的杀伤能力与更广的杀瘤谱。⑶3+CD56+细胞在正常人外周血中含量极低，仅1% — 5%。因此，在体外培养中，提高其绝对数量对提高临床治疗效果至关重要。目前的经典制备方法为:采集人体外周血，分离得到单个核细胞，将单个核细胞置于培养液中，加入多种细胞因子诱导其分化(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN- Y等)培养至第21天，收获得到⑶3+⑶56+细胞。但这种方法获得的CD3+CD56+细胞的培养周期过长且细胞毒活性不够理想。以下是现有技术的一种方案:1、采集自体外周血，存放于密闭容器中，以枸橼酸钠抗凝。2、将采集的血液经离心分离，得到外周血单个核细胞。3、调节细胞浓度I X 106/mL,并加入细胞因子IFN- Y至其终浓度为1000U/mL，于37 0C，5%C02培养箱中孵育24h。4、24h后加入IL-2、抗CD3单克隆抗体及IL-1，至IL-2终浓度为300 500U/mL，抗⑶3单克隆抗体终浓度为50ng/mL及IL-1终浓度为100U/mL。之后每隔3天半量换液，全量补充IL-2。5、第21天收获细胞。此方案的缺点是:1、现有技术采用病人自体外周血，受病人个体差异的影响较大，不利于产业化制备，给临床推广带来了难度。2、外周血属于发育成熟的机体组织，细胞增殖潜力较小，受病毒感染的风险高，且年龄越大细胞活性越低。3、枸橼酸钠抗凝剂本身对细胞有一定的毒性，并且其用量较大，碱性强，对血液成分的影响较大。4、现有技术所制备的免疫细胞，其对肿瘤细胞的杀伤性还有待提高。有鉴于此，如何设计一种⑶3+⑶56+细胞的制备方法，以解决现有技术制备周期较长及细胞的增值潜力较小的现象，是业内人士亟需解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术中，血液成分的稳定性不佳、采集过程缺乏安全性，并且细胞的制备周期较长，增殖潜力较小等缺陷，本专利技术提供了一种来源于围产期胎盘血高杀伤K562细胞的⑶3+⑶56+细胞的制备方法。根据本专利技术，提供了一种来源于围产期胎盘血高杀伤K562细胞的⑶3+⑶56+细胞的制备方法，其中，从围产期胎盘血中分离单个核细胞以诱导分化形成CD3+CD56+细胞。优选地，包括以下步骤:a.采集所述围产期胎盘血于密闭容器内；b.从所述围产期胎盘血中分离单个核细胞；以及c.诱导分化所述单个核细胞。优选地，所述步骤a中，所述围产期胎盘血以含肝素钠抗凝剂抗凝。优选地，用含肝素钠抗凝剂的采血袋进行采血，摇匀后，将所述采血袋和生物冰袋一起放入保温箱， 保持温度为4 25°C，温差不超过±5°C，在6小时内运送所述采血袋至实验室，且运输途中避免血液经X线照射并远离辐射源。优选地,所述步骤b包括:bl.向第一离心管中加入淋巴细胞分离液，将所述围产期胎盘血以等体积D-Hank’s液稀释混匀，并将稀释后的所述围产期胎盘血缓慢叠加于所述淋巴细胞分离液之上，保持液层分界清晰；稀释后的所述围产期胎盘血体积与所述淋巴细胞分离液体积比为2:1 ；b2.将所述第一离心管进行离心，其中，以800 1200g的离心力在10 25°C下离心25 30min ；b3.吸取所述第一离心管内的上层血浆，密封并冷藏，冷藏温度为-20°C，吸取所述第一离心管内的单个核细胞层液体，移入第二离心管内；b4.向所述第二离心管内加入D-Hank’s液以稀释所述单个核细胞层液体，所述D-Hank’s液与所述单个核细胞层液体的体积比为5:1，离心洗涤所述第二离心管，去除上清；以及b5.用含体积浓度为10%胎牛血清的RPM1-1640培养液重悬所述单个核细胞，调节所述单个核细胞密度为I 3X 106/mL。优选地,所述步骤b4中，以300 500g的离心力在4°C下离心5 lOmin。 优选地,所述步骤c包括:Cl.将所述步骤b5中的所述含单个核细胞的培养液移入培养瓶，加入IFN- y至所述IFN-Y终浓度为500 1600U/mL，将所述培养瓶置于37°C，CO2的体积浓度为5%的培养箱中孵育24h ；c2.继续向所述培养瓶内加入IL-2、抗⑶3单克隆抗体、SCF及IL-1至所述IL_2终浓度为500 1000U/mL，所述抗⑶3单克隆抗体终浓度为50 100ng/mL，所述SCF终浓度为40 80ng/mL及所述IL-1终浓度为100 300U/mL，然后每隔1 3天半量换液，全量补充IL-2、抗⑶3单克隆抗体、IL-1、SCF，保证细胞密度处于1 3X 106/mL ;以及c3.至第14 17天收获经分化的所述单个核细胞，离心并用所述培养液重悬，检测所述单个核细胞中CD3+CD56+细胞含量。优选地，所述步骤Cl中，所述IFN- Y的终浓度为1000U/mL。优选地，所述步骤c2中，所述IL-2的终浓度为750U/mL。优选地，所述步骤c2中，所述抗⑶3单克隆抗体的浓度为75ng/mL，所述SCF的浓度为55ng/mL,所述IL-1的浓度为150U/mL。本专利技术的优点是:1、重新选择抗凝剂，设计新型采血装置，保证血液成分的稳定性以及采集过程的方便安全。2、采集围产期胎盘血以从中分离单个核细胞，其增殖潜力比外周血单个核细胞更高，受病毒感染的风险更低。3、重新调整细胞因子的使用，进一步提高细胞增殖数量。4、缩短了制备周期，便于产业化实施。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1示出了依据本专利技术的来源于围产期胎盘血高杀伤K562细胞的⑶3+⑶56+细胞的制备方法中，离心第一离心管后的液体分层状态示意图。图2A 2F示出了在100倍显微镜下观察到的依据本专利技术收获的单个核细胞在不同培养时间下的细胞状态。图3A 3F示出了不同时期细胞群体中⑶3+CD56+细胞含量流式检测图。图4A与4B示出了 1号围产期胎盘血通过本专利技术最终达到的细胞群体中⑶3+⑶56+细胞含量流式检测图谱。图5A与5B示出了 2号围产期胎盘血通过本专利技术最终达到的细胞群体中⑶3+⑶56+细胞含量流式检测图谱。图6A与6B示出了 3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于围产期胎盘血高杀伤K562细胞的CD3+CD56+细胞的制备方法，其特征在于，从围产期胎盘血中分离单个核细胞以诱导分化形成CD3+CD56+细胞。

【技术特征摘要】
1.一种来源于围产期胎盘血高杀伤K562细胞的⑶3+⑶56+细胞的制备方法，其特征在于，从围产期胎盘血中分离单个核细胞以诱导分化形成CD3+CD56+细胞。2.如权利要求1所述的来源于围产期胎盘血高杀伤K562细胞的CD3+CD56+细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: a.采集所述围产期胎盘血于密闭容器内； b.从所述围产期胎盘血中分离单个核细胞；以及 c.诱导分化所述单个核细胞。3.如权利要求1所述的来源于围产期胎盘血高杀伤K562细胞的CD3+CD56+细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤a中，所述围产期胎盘血以含肝素钠抗凝剂抗凝。4.如权利要求3所述的来源于围产期胎盘血高杀伤K562细胞的CD3+CD56+细胞的制备方法，其特征在于，用含肝素钠抗凝剂的采血袋进行采血，摇匀后，将所述采血袋和生物冰袋一起放入保温箱，保持温度为4 25°C，温差不超过±5°C，在6小时内运送所述采血袋至实验室，且运输途中避免血液经X线照射并远离辐射源。5.如权利要求1所述的来源于围产期胎盘血高杀伤K562细胞的CD3+CD56+细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤b包括: bl.向第一离心管中加入淋巴细胞分离液，将所述围产期胎盘血以等体积D-Hank’ s液稀释混匀，并将稀释后的所述围产期胎盘血缓慢叠加于所述淋巴细胞分离液之上，保持液层分界清晰；稀释后的所 述围产期胎盘血体积与所述淋巴细胞分离液体积比为2:1 ; b2.将所述第一离心管进行离心，其中，以800 1200g的离心力在10 25°C下离心25 30min ； b3.吸取所述第一离心管内的上层血浆，密封并冷藏，冷藏温度为-20°C，吸取所述第一离心管内的单个核细胞层液体，移入第二离心管内； b4.向所述第二离心管内加入D-Hank’s液以稀释所述单个核细胞层液体，所述D-Hank’s液与所述单个核细胞层液体的体积比为5:1，离心洗涤所述第二离心管，去除上清；以及 b5.用含体积浓度为10...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘乐锋，王溢文，魏昌盛，林强，刘洋，
申请(专利权)人：江苏和泽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：