本发明专利技术属于分子免疫学领域，具体涉及一种由鸡肝脏、胆囊和胆管上皮细胞分泌和释放的胞外体，且公开了其制备方法，该胞外体中含有C-反应蛋白（C-reactive?protein）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate?aminotransferase）、玻连蛋白（Vitronectin）等肝源性的蛋白成分、上皮细胞源性的粘蛋白(Mucin)以及免疫球蛋白(Immunoglobulin)等免疫反应相关蛋白，可以作为研究肝脏疾病的生物指标以及作为免疫反应佐剂，参与免疫调节，还可以作为载体，应用于治疗肝脏、胆囊和肠道疾病的治疗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学，具体涉及一种从鸡胆汁中提取的胞外体的方法及其在免疫学上的应用。
技术介绍
胞外体,又称“外源体” (Exosomes),是一种来源于晚期内涵体的直径20_170nm的小囊泡。1987年，Johnstone研究网织红细胞最后成熟为红细胞的实验中，将在体外培养的绵羊的网织红细胞释放的小囊泡命名为胞外体。1996年Raposo等发现B细胞分泌的胞外体能诱导抗原特异性T淋巴细胞反应，Zitvogel等用树突状细胞来源胞外体成功诱导CD8+T淋巴细胞发挥很强的抗肿瘤效应，近年来研究者对胞外体的免疫作用给予了高度的关注，成为非细胞性肿瘤疫苗研究的热点。胞外体的来源及特征除了网织红细胞以外，多种细胞均分泌胞外体，如B细胞(Raposo G，1996)、肥大细胞(Skokos D，2001)、不成熟树突状细胞(ne) (Thery C，2001)、血小板、纤维母细胞、上皮细胞(Wolfers J，2001)、肿瘤细胞、T淋巴细胞(Blanchard N，2002)等。各种细胞来源的胞外体的分子组成不尽相同，但一般而言，不同类型细胞分泌的胞外体大小均在20-170nm，浮力密度为I. 12-1. 21g/mL (Smalheiser，2007)，主要含有以下几种物质主要组织相容复合物 I (major histocompatibility complex I ,MHC I )类和 / 或II类分子、热休克蛋白、整合素、四跨膜蛋白、细胞骨架蛋白以及一些生物酶类。在胞外体的发现之初，人们认为胞外体的作用只是在红细胞成熟中移除无用的蛋白，但现在看来它的功能更加复杂。每种胞外体的生物学功能与其来源密切相关。在大量研究的基础上发现，胞外体的主要作用包括以下几个方面移除无用蛋白；作为细胞间交流的媒介；诱导免疫耐受；在免疫调节中发挥重要作用，包括免疫激活或免疫抑制。胞外体作为自体成分，有易吸收，无排斥反应等优点，目前作为多种肿瘤药物的载体应用于肿瘤治疗的研究中。胆汁中的胞外体胆汁是在胆道中流动的一种特殊的体液，由肝脏分泌产生。胆汁的生成过程非常复杂，胆汁由约75%肝细胞生成，25%由胆管细胞和胆囊上皮细胞生成，。胆汁有两大作用，一是作为消化液，帮助脂肪在肠内的消化和吸收；二是将某些代谢产物从肝脏排出。鸡胆汁是一种资源丰富、作用广泛、价格低廉的天然中药。鸡胆汁性味苦寒，无毒，具有清热解毒、止咳平喘、消炎、利胆明目等功能。胆汁中的胞外体，是由肝细胞、上皮细胞分泌和释放后汇集于胆囊的蛋白囊泡，最终释放到小肠内。由于表面携带有大量的抗原肽和淋巴细胞共刺激因子等，在机体内，胆汁中的胞外体对维持肠道免疫系统的稳态和肝脏免疫反应起着重要作用。胞外体作为自体成分，有易吸收，无排斥反应等优点，目前作为多种肿瘤药物的载体应用于肿瘤治疗的研究中。胆汁中的胞外体可以定向作用于肝脏和肠道，可以作为治疗肝脏和肠道疾病的重要工具。现阶段的研究与应用前景目前，鼠类上进行的胞外体的应用实验取得了丰富的研究成果，并为人药研究提供了很好的参考。在人医方面，成熟树突状细胞分泌胞外体由于其可以有效诱导免疫激活反应在其基础上研究的药物已进入二期临床阶段；胞外体作为载体的制备和应用在我国已于2005年申请专利(CN200510082604)。禽源胆汁胞外体的研究在国内外未见报道。但是禽源胆汁来源丰富、作用广泛、价格低廉，具有清热解毒、止咳平喘、消炎、利胆明目等功能，在我国中医学列入天然中药。鸡胆汁中的胞外体如果应用于禽的肿瘤性疾病的治疗中，可能能够改变肿瘤性疾病一旦感染就必须淘汰的现状，这将是养禽业的福音；作为抗应激药物，可以有效防止长途运输等由于应激造成的胃肠道疾病，将为养殖业挽回大量损失。再者，鸡常作为肿瘤、动脉粥样硬代的动物模型，禽源胆汁的研究成果对于人医很高的参考价值。
技术实现思路
为了提高鸡胆汁中胞外体的提取效率，以及扩展胞外体在免疫学上的应用，本专利技术的专利技术人提供了一种新的由鸡肝脏、胆囊和胆管上皮细胞分泌和释放的胞外体，且公开了其制备的方法，该胞外体中含有C-反应蛋白(C-reactive protein)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase)、玻连蛋白(Vitronectin)等肝源性的蛋白成分,上皮细胞源性的粘蛋白(Mucin)以及免疫球蛋白(Immunoglobulin)等免疫反应相关蛋白，可以作为研究肝脏疾病的生物指标以及作为免疫反应佐剂，参与免疫调节，还可以作为载体，应用于治疗肝脏、胆囊和肠道疾病的治疗。 本专利技术提供胞外体具有典型杯状结构的双层脂质膜，含有肝源性的蛋白成分，所述的肝源性的蛋白成分为C-反应蛋白或天冬氨酸氨基转移酶或玻连蛋白或其混合物；所述的胞外体是胆汁中正常存在的成分，由肝脏(约占75%)、胆管和胆囊上皮细胞(约占25%) 分泌和释放。且该胆汁为各个品系的肉鸡、蛋鸡等禽类均可获得的胆汁。本专利技术的专利技术人对禽源胞外体蛋白组分的研究发现，其表面携带有多种独特蛋白，其中的C-反应蛋白，由肝细胞产生，是急性期反应蛋白，作为炎症反应的标志具有重要意义；玻连蛋白，其表达的差异常作为判断肝细胞癌的标准，表明禽源胞外体可以作为判定；粘蛋白由上皮细胞产生，起到润滑及细胞信号的传导等多种功能，可以形成化学屏障； 大量免疫球蛋白的存在，说明了胞外体在免疫应答信息传递中具有重要作用。所获得的胞外体直径在30-150nm，质量密度范围为I. 13-1. 19g/cm3。该胞外体表面上呈递有MHC I分子或可与MHC I分子结合的抗原肽，或带有淋巴细胞共刺激分子，或上述物质共存。其中上述的MHC I分子在免疫反应中具有正相关性，较之以往都是呈现MHC II 相关性具有显著不同，因此在免疫学应用上有着全新的突破。制备上述胞外体的方法，具体步骤如下将从健康鸡胆囊离体4h内抽取的胆汁，在4°C低温条件下经逐级离心去细胞碎片取上清，经滤膜过滤，4°C 110, OOOg离心2h沉淀用PBS重悬，然后4°C 110, OOOg离心90min 后用PBS溶解沉淀，即为提取的胞外体。其中所述的逐级离心为1000 2000g 15 20min，3000 4000g 20 30min， 7000 8000g 45 50min，10000 15000g 40 60min。更进一步的优选釆用逐级离心为2000gl5min，4000g30min,8000g45min, 15000g 60mino为了达到更好的效果,所述经过4°C 110, OOOg离心90min后的沉淀通过30wt%、45wt%、60wt%的鹿糖溶液进行密度梯度离心,这样就可以进一步的分离出胞外体,提高胞外体的均一度。具体方法为现有技术，可以采用在一个离心管中通过现有技术形成3层密度不同度的鹿糖梯度，从下到上依次是60wt%、45wt%、30wt%,最上层是样品沉淀,经离心后样品层分离，渗入到其密度所在层，实现依密度的不同的分离。采用上述分级离心与过滤相结合的制备方法，可以有效去除胆汁中的残渣及大分子物质，较单一的离心或过滤的方法，更为可行。存在以下优越性 I.提取过程耗时短，易于保持胞外体的生物活性，形态保持良好，均一度较高。2.胞外体的产量高，Im本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种从鸡胆汁中提取的胞外体，其特征在于该胞外体具有典型杯状结构的双层脂质膜，含有肝源性和上皮细胞源性的蛋白成分，所述的肝源性的蛋白成分为C-反应蛋白或天冬氨酸氨基转移酶或玻连蛋白或其混合物；所述的上皮细胞源性的蛋白成分为粘蛋白。2.根据权利要求I或所述的胞外体，其特征在于该胞外体还携带免疫球蛋白或多聚免疫球蛋白受体或其混合物。3.根据权利要求I或2所述的胞外体，其特征在于所述胞外体直径在30-150nm，质量密度范围为I. 13-1. 19g/cm3。4.根据权利要求2所述的胞外体，其特征在于该胞外体表面上呈递有MHCI分子或可与MHC I分子结合的抗原肽，或带有淋巴细胞共刺激分子，或上述物质共存。5.制备如权利要求I所述的胞外体的方法，其特征在于具体步骤如下 将从SPF鸡或其他经过常规免疫的商品禽类胆嚢，离体4h内抽取的胆汁，胆汁在4°C低温条件下经逐级离心去细胞碎片取上清，经滤膜过滤，依次4°C 110, O...
【专利技术属性】
技术研发人员：成子强，王玥，王桂花，王真真，姜艳萍，于琳琳，张利，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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