一种体外扩增γδT细胞的方法技术

本发明专利技术涉及γδT细胞培养方法，具体涉及一种体外扩增γδT细胞的方法，该方法的操作步骤如下：抗TCRγδ抗体和CD28McAb预先包被T75培养瓶，备用。分离患者外周血单个核细胞（PBMC），用含5%自体血浆的无血清培养基将PBMC浓度调整为1×106?/ml，再将PBMC细胞悬液转入T75培养瓶中，加入含有适当浓度Zoledronat，HSP70，IL-2，IL-7，IL-15的初始培养基，37℃、5%CO2的饱和湿润环境中培养，根据细胞的生长情况，每2~3天更换培养基，将细胞浓度控制在2.5×106?/ml左右，同时全量补充Zoledronat，HSP70，IL-2和IL-7，IL-15，持续培养12~16天后，即可获得大量较高纯度的γδT细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种体外扩增Y δ T细胞的方法本专利技术涉及Y δ T细胞培养方法，具体涉及一种体外扩增Y δ T细胞的方法。根据T细胞表面受体(TCR)的不同可将T淋巴细胞分为两种α β T淋巴细胞和Y s T淋巴细胞。在人体中，α β T淋巴细胞是参与免疫应答的主要细胞群，占成熟T细胞的90 95%，而Y δ T细胞仅占外周血T淋巴细胞的O. 5%_5%，但Y δ T细胞是先于α β T细胞出现的，主要分布于皮肤，小肠、食道、肺和生殖器官等上皮组织内。Y S T细胞属于机 体的第一线防御细胞，在抗微生物感染免疫，尤其是在皮肤黏膜表面的免疫防御功能中，以及抗分枝杆菌感染中发挥重要作用。此外，研究还发现，Y S T细胞具有无MHC限制性的杀瘤作用，对多种自体、同种异体或异种肿瘤细胞均表现出显著的杀伤活性，因此，Y ST细胞作为一类重要的肿瘤过继免疫治疗的候选细胞正在引起越来越多国内外学者的关注。但是另一方面，由于Y S T细胞在人体中所含比例较低，分离纯化到大量的Y δ T细胞较为困难，因而限制了其临床使用。因此Y ST细胞体外高效扩增是解决这一问题的主要方法。在这一领域，人们做了很多有益的尝试，国内在体外培养扩增Y δ T细胞通常采用IPP和IL-2共刺激法，但因费用相对昂贵且扩增倍数不足而未被广泛使用。因此，为了克服现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种新的Y δΤ细胞的方法，该方法操作简便，价格便宜，扩增Y δ T细胞效率高。本专利技术的目的是提供一种体外高效扩增Y δ T细胞的方法，提高Y δ T细胞的纯度和杀伤活性，使Y S T细胞更适用于临床。为实现上述目的，设计一种体外扩增Y δ T细胞的方法，该方法由以下步骤组成a.用抗TCR Y δ抗体和CD28McAb预先包被T75培养瓶以备用，b.将外周血单个核细胞转入包被的T75培养瓶中，加入含有唑来膦酸(Zoledronat)、HSP70、IL-7、IL-15和IL-2的无血清培养基，放入二氧化碳培养箱培养12^16天后获得大量较高纯度的Y δ T细胞。上述方法还具有如下优化方案抗TCR Y δ抗体浓度为I yg/ml。 所述CD28McAb的在无血清培养基中的浓度为500ng/ml。所述的唑来膦酸在无血清培养基中的浓度为1.00 μ δ/πιΓ3. 87 Ug/mL·所述唑来膦酸在无血清培养基中的浓度为1.29 yg/mL·所述HSP70在无血清培养基中的浓度为10 μ g/ml 50 μ g/mL·所述HSP70在无血清培养基中的浓度为20 μ g/mL·所述IL-7在无血清培养基中的浓度为10ng/ml。所述IL-15在无血清培养基中的浓度为50ng/ml。所述IL-2在无血清培养基中的为1000IU/ml。本专利技术提供了一种新的Y δ T细胞的体外培养方法，与常规培养方法相比，本方法的优越之处有以下几点(I)采用抗TCR Y δ抗体和⑶28McAb两种抗体包被，抗TCRγ δ抗体提供了 γ δΤ细胞活化的第一信号，CD28McAb则为Y δ T细胞的活化提供了共刺激信号，使静息的、δΤ细胞得到充分的激活；(2) TCRy δ具有庞大的序列多态性，目前已有两类分子被证实是TCRy δ配体含磷酸基的非肽类小分子和热休克蛋白；用IPP刺激Y δ T细胞时所需浓度较高，加之IPP的价格昂贵，如果培养至临床所需要的细胞数量则培养成本较高，而唑来膦酸(Zoledronat)可以在较低的浓度下激活Y δ T细胞,所以选择使用合适浓度的Zoledrona来刺激Y δ T细胞，使其大规模培养成为可能；HSP70不仅能携带特异性肿瘤抗原，还可作为抗原呈递分子直接将抗原肽呈递给Y δ T细胞，使其活化增殖，发挥细胞毒和分泌细胞 因子的双重功能；(3)IL-2、IL_7和IL-15三种细胞因子组合的应用。IL_7是促进人类Y δ T前体细胞增殖和促进Y δ T分化成熟的重要因子；IL-15是一种多功能的细胞因子，促进T细胞的增值，此外IL-15可抑制活化的T细胞和B细胞由于抗Fas抗体、细胞因子耗竭、地塞米松等因素所致的凋亡；IL-2是T细胞的生长因子；三种细胞因子的组合使用既降低了单种因子的用量，使培养成本无明显提高，又保证了发挥作用的全面性，大幅提高了 Y ST细胞的增值倍数和毒性。附图说明图1是两组培养方法下Y δ T细胞扩增倍数的比较图；图2是两组培养方法下Y δ T细胞纯度的比较图；图3是两组培养方法下Y δ T细胞对SGC-7901细胞杀伤活性的比较图；为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本专利技术进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1:一、外周血单个核细胞(PBMC)的分离与培养机器采集PBMC，将采集的血样转至离心管；700g，IOmin离心分离，吸取上层血浆培养时备用；血样标本还原至原体积，混勻；稀释血缓慢加在Ficoll上，900g,离心20min ；吸取分离液界面乳白色单个核细胞层；离心洗涤2次并计数；用Y δ T初始培养基将细胞重悬至I X IO6 /ml ;根据细胞的生长情况，每2 3天更换培养基，所用培养基为含5%自体血浆的无血清培养基。在37°C、5%C02的饱和湿润环境中培养，根据细胞的生长情况，每2 3天更换培养基，将细胞浓度控制在2. 5X IO6 /ml左右，同时全量补充各种因子其中试验组补充唑来膦酸(Zoledronat)，HSP70, IL-2，IL-7和IL-15，常规组补充IPP和IL-2，持续培养12 16天后，即可获得大量较高纯度的Y δΤ细胞。二、实验方法与常规方法的细胞扩增倍数的比较分别在第0、4、8、12、14及16天从两组取培养细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数(即第O天)，数值即为细胞的扩增倍数。以此方法可以动态比较两组细胞的扩增情况，结果如表I和图1所示，在培养的第4、8、12、14和16天，两组的Y δ T细胞均在扩增，但是每个时间点实验组的Y δ T细胞扩增情况均好于常规组，第14天时两组均达到扩增最高点，其后细胞扩增速度变缓，第16天显微镜下可观察到凋亡细胞碎片。表I权利要求1.一种体外扩增Y S T细胞的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成a.用抗TCRY δ抗体和⑶28McAb预先包被T75培养瓶以备用，b.将外周血单个核细胞转入包被的T75培养瓶中，加入含有唑来膦酸、HSP70、IL-7、 IL-15和IL-2的无血清培养基，放入二氧化碳培养箱培养12 16天后获得大量较高纯度的 Y δΤ细胞。2.如权利要求1所述的体外扩增Yδ T细胞的方法，其特征在于抗TCR Y δ抗体浓度为 I μ g/ml03.如权利要求1所述的体外扩增YδΤ细胞的方法，其特征在于所述CD28McAb的在无血清培养基中的浓度为500ng/ml。4.如权利要求1所述的体外扩增YS T细胞的方法，其特征在于所述的唑来膦酸在无血清培养基中的浓度为1.00 μ δ/πιΓ3. 87 yg/mL·5.如权利要求1所述的体外扩增YS T细胞的方法，其特征在于所述唑来膦酸在无血清培养基中的浓度为1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外扩增γδT细胞的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：a.用抗TCRγδ抗体和CD28McAb预先包被T75培养瓶以备用，b.将外周血单个核细胞转入包被的T75培养瓶中，加入含有唑来膦酸、HSP70、IL?7、IL?15和IL?2的无血清培养基，放入二氧化碳培养箱培养12~16天后获得大量较高纯度的γδT细胞。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：解尚云，叶永清，谭令兵，
申请(专利权)人：上海柯莱逊生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：