一种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白及其方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种重组蛋白及其方法和应用，具体为一种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白及其方法和应用，其氨基酸序列表如SEQ?ID?NO：1所示，制备时，将GM-CSF、TAT和CEA通过酶切克隆到质粒pET-15b的克隆位点中构建重组质粒，重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，进行重组蛋白的表达，最后进行重组蛋白转化体的纯化收集，本发明专利技术的重组蛋白可应用于肿瘤治疗药物。本发明专利技术将肿瘤特异性抗原和转导蛋白以及体外诱导DC细胞的关键试剂GM-CSF结合，制备出具有特异性且能延缓DC细胞寿命的融合蛋白，保证了DC细胞存活时间的延长以及特异性免疫应答的启动；避免了常规DC细胞培养中GM-CSF的额外添加，解决了培养周期中GM-CSF不足的缺点，并且共表达GM-CSF还可促进细胞毒作用；为肿瘤临床治疗提供了新的依据。

【技术实现步骤摘要】
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]本专利技术涉及一种重组蛋白及其方法和应用，具体为一种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白及其方法和应用。[
技术介绍
]肿瘤发生发展的根本原因之一是机体的免疫系统不能对其生长进行有效地控制，对此加以纠正，使机体的免疫系统能有效产生对肿瘤细胞的免疫排斥反应是近百年来人们一直研究的课题。肿瘤疫苗是该方面研究的主要内容，在众多的肿瘤疫苗中，根据抗原提呈细胞在肿瘤免疫中的重要作用而设计的树突状细胞（dendritic cells，DC）瘤苗是目前研究最热门方向。机体的免疫应答首先由抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)捕获、加工和处理抗原，再将抗原递呈给T,B淋巴细胞,从而引发一系列的免疫应答。树突状细胞(dendritic cell，DC)作为功能最强的APC,能激活静息型T细胞(naive T cell)，激发初始免疫应答,在体内发挥强大的免疫监视功能。肿瘤患者体内DC功能缺陷,不能有效递呈肿瘤抗原,导致免疫无能或免疫耐受,使肿瘤得以发生发展。应用DC瘤苗治疗肿瘤最引人瞩目的研究工作是应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏（pulsing）DC，然后将之回输或免疫接种至行瘤宿主，进行肿瘤免疫治疗，已证明该疗法能显著地诱导机体产生抗原特异性CTL，产生保护性免疫反应并能治疗已建立的荷瘤模型，这些研究为肿瘤的治疗提供了新的思路，将DC过继回输已在临床用于肿瘤病人的治疗，取得了一定疗效，表明该疗法具有一定的临床应用的可行性。DC的抗原递呈功能是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的基础，DC的体外大量诱导扩增是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的前提，DC瘤苗的体外构建是DC瘤苗的抗肿瘤免疫治疗的关键。[
技术实现思路
]针对现阶段应用常规方法所诱导的DC细胞具有抗原特异性不高以及过早凋亡等方面的不足。本专利技术提供了一种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白的制备方法，使诱导的DC细胞在抗原特异性和生存周期上都有了很大程度的提高，为后续的特异性免疫应答提供了很好的基础条件。本专利技术为肿瘤免疫治疗奠定了良好的基础。为实现上述目的，设计一种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白，其氨基酸序列表如SEQ ID NO：1所示。本专利技术还涉及一种制备上述重组蛋白的方法，该方法由以下步骤组成：a.将GM-CSF、TAT和CEA通过酶切克隆到质粒pET-15b的克隆位点中构建重组质粒，b.重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，进行重组蛋白的表达，c.重组蛋白转化体的纯化收集：通过Ni-NTA柱分离纯化所述的重组蛋白。在所述的步骤（a）中的酶切为：在GM-CSF的基因序列两端添加酶切位点Nde I和Nco I，在TAT的基因序列两端添加酶切位点Xho I和Nde I，以及在CEA的基因序列两端添加酶切位点BamH I和Xho I。本专利技术的重组蛋白可应用于肿瘤治疗药物。本专利技术还包括一种上述重组蛋白制备DC疫苗的方法，将所述重组蛋白刺激诱导健康C57BL/6小鼠经由骨髓制备的DC细胞，制得DC疫苗。所述的重组蛋白的浓度为25～100ug/ml，优选为25～50ug/ml。本专利技术将特异性的肿瘤抗原与DC瘤苗相关因子基因相重组，得到可肿瘤免疫治疗所需的特异、高效的重组蛋白。无论从理论上还是实际治疗上都有着很大的进步。随着DC体外诱导扩增技术的发展及分子生物学技术和基因工程技术应用于DC瘤苗构建方法的发现，使得产量增大、纯度提高、制备更容易等优点，更能满足实验和临床研究的需要。DC瘤苗用于肿瘤免疫治疗的实验和临床研究更趋成熟，DC瘤苗有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效方式。故专利技术了一种肿瘤特异性抗原结合细胞因子等刺激DC细胞制备DC疫苗所需的GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白，并可有效激发体内抗原特异性免疫反应用于肿瘤的预防及治疗。与常规利用肿瘤细胞裂解物诱导DC细胞的方法相比，本专利技术创新优越之处有以下几点：首先，利用基因工程方法将肿瘤特异性抗原和转导蛋白以及体外诱导DC细胞的关键试剂GM-CSF结合，制备出具有特异性且能延缓DC细胞寿命的融合蛋白，保证了DC细胞存活时间的延长以及特异性免疫应答的启动；其次，重组蛋白的成功制备，避免了常规DC细胞培养中GM-CSF的额外添加，解决了培养周期中GM-CSF不足的缺点，并且共表达GM-CSF还可促进细胞毒作用；再者增强了肿瘤抗原的特异性，针对性的解决了以CEA为标志性抗原的肿瘤免疫治疗，为肿瘤临床治疗提供了新的依据。[附图说明]图1是不同疫苗刺激机体ELSPOT检测IFN-gama斑点数的图表，图2是不同疫苗刺激机体特异性反应ELSPOT检测IFN-gama斑点数的图表，图3是不同组肿瘤块体积的图表，图4是不同剂量重组蛋白刺激机体特异反应ELSPOT检测分析图表，图5是MC-38-cea2细胞毒实验图表，图6是MC38细胞毒实验图表，图7是质粒pET-15b的图谱[具体实施方式]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本专利技术进行进一步详细说明。本申请中的生产设备都是本领域的常用设备，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1：本实施例中：人源结肠癌Lovo细胞株特异性抗原CEA来自NCBI，序列号为CAE75559；TAT跨膜肽来自NCBI，序列号为NP_057853，粒细胞集落刺激生长因子GM-CSF来自NCBI，序列号为AAA52578。质粒pET-15b图谱如图7所示，a、利用基因合成技术，分别合成人源结肠癌Lovo细胞株特异性抗原CEA的基因序列、TAT跨膜肽的基因序列以及GM-CSF的基因序列。其中，粒细胞集落刺激生长因子GM-CSF基因序列两端加酶切位点Nde I和Nco I；TAT跨膜肽的基因序列两端加酶切位点Xho I和Nde I；在CEA基因序列两端加酶切位点BamH I和Xho I；利用基因重组技术将合成的这三段基因序列通过酶切克隆到质粒pET-15b上面构建成重组质粒；再将重组质粒转染大肠杆菌BL21细胞，并确保细胞密度在2×106进行转染，37℃培养4天后取出细胞悬液；利用Ni-NTA柱分离纯化GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白，即可得到GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白，其氨基酸序列为GM-CSF27-138aa-TAT47-57-CEA605-613，详细如SEQ ID NO:1所示。其中结肠癌Lovo细胞株和质粒pET-15b本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种GM?CSF?TAT?CEA重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

【技术特征摘要】
2012.12.14 CN 201210545700.X1.一种GM-CSF-TAT-CEA重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种制备权利要求1所述重组蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组
成：
a.将GM-CSF、TAT和CEA通过酶切克隆到质粒pET-15b的克隆位点中构建重
组质粒，
b.重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，进行重组蛋白的表达，
c.重组蛋白转化体的纯化收集。
3.如权利要求2所述的制备重组蛋白的方法，其特征在于在所述的步骤（a）所
述的酶切为：在GM-CSF的基因序列两端添加酶切位点Nde I和Nco I，在TAT
的基因序列两端添...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶永清，张超，苏国新，
申请(专利权)人：上海柯莱逊生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：