一种用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法技术方案

本发明专利技术涉及一种TAT-凋亡素融合蛋白的方法，具体涉及一种用Bac-to-Bac系统表达TAT-凋亡素融合蛋白的方法。TAT-凋亡素基因亚克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中，转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，蓝白斑筛选获得阳性克隆，从阳性克隆中抽提质粒DNA，用此所获得的重组杆状病毒DNA转染家蚕细胞BmN，获得含有TAT-凋亡素基因的重组杆状病毒，再用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，最终大量表达TAT-凋亡素融合蛋白，本发明专利技术用家蚕细胞表达的重组TAT-凋亡素融合蛋白，具有较高的表达量及生物活性，为利用家蚕生物反应器生产大量该蛋白打下基础。

【技术实现步骤摘要】
—种用Bac-to-Bac系统表达TAT-调亡素融合蛋白的方法本专利技术涉及一种TAT-凋亡素融合蛋白的方法，具体涉及。凋亡素(apoptin)是由鸡贫血病毒(CAV)VP3基因编码的蛋白质，由121个氨基酸组成，NCBI中的序列编号为NC_001427，可以特异性地诱导动物和人体肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有影响。凋亡素选择性诱导肿瘤细胞的凋亡是非P53依赖的bcl-2对抗机制，由于大部分肿瘤细胞具有P53突变或缺少的特性，因此，非p53依赖性凋亡素作为抗肿瘤药物具有很好的应用前景。 天然状态下的凋亡素很难透过细胞膜屏障进入肿瘤细胞内发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。现已证明，人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的反式激活蛋白(trans-activatortranscription, TAT)具有蛋白转导结构域的特点，能快速有效地将与之相连的肽段或蛋白质直接跨膜转运进入细胞或组织，转导效率很高且对细胞没有损伤。TAT的编码序列为YGRKKRRQRRR，利用TAT介导蛋白质进入细胞的有效方法是将TAT的编码基因与外源蛋白基因连接，表达融合蛋白。2004年Guelen等研制出含TAT跨膜功能域的凋亡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用Bac?to?Bac系统表达TAT?凋亡素融合蛋白的方法，其特征在于：i.将TAT?凋亡素基因从pUC57?TAT?凋亡素中亚克隆至Bac?to?Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTb的多克隆位点中，ii.将该质粒转化入含有家蚕杆状病毒Bacmid基因组的感受态细菌DH10BmBac细胞内，在含有抗生素的培养板上过夜培养，蓝白斑筛选获得阳性克隆，从阳性克隆中抽提质粒DNA，iii.用此所获得的重组杆状病毒DNA转染家蚕细胞BmN，72h后分离培养基上清液，获得含有TAT?凋亡素基因的重组杆状病毒，iv.再用收集到的重组杆状病毒大量感染BmN细胞，最终大量表达TAT?凋亡素...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊红，陆玲玲，叶永清，苏国新，
申请(专利权)人：上海柯莱逊生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：