一种流感病毒四价亚单位疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种流感病毒四价亚单位疫苗及其应用，属于医药技术领域。本发明专利技术采用杆状病毒表达系统来快速制备获得高纯度的三聚体蛋白质疫苗，所得疫苗免疫原性强，生产周期短，并且不存在任何的安全隐患，可以预防多种亚型的流感病毒。

An influenza virus tetravalent subunit vaccine and its application

The invention discloses an influenza virus tetravalent subunit vaccine and its application, and belongs to the technical field of medicine. The invention adopts the baculovirus expression system to obtain rapid preparation of trimeric protein vaccine with high purity, the vaccine immunogenicity, short production cycle, and there is no any safety hazards, can prevent a variety of subtypes of influenza virus.

【技术实现步骤摘要】
一种流感病毒四价亚单位疫苗及其应用
本专利技术涉及一种流感病毒四价亚单位疫苗及其应用，属于医药

技术介绍
流行性感冒病毒(influenzavirus)，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，流感病毒属于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)。流感病毒会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。流行性感冒病毒在免疫力较弱的老人或小孩及一些免疫失调的病人会引起较严重的症状，如肺炎或是心肺衰竭等。流感病毒主要由囊膜和核衣壳构成，囊膜由纤突、双层类脂膜和基质蛋白(M)构成。纤突分为两类：一类呈棒状，由血凝素(HA)分子的三聚体构成；另一类呈蘑菇状，由神经氨酸酶(NA)分子的四聚体构成。双层类脂膜为病毒粒子出芽时从宿主细胞膜获得的。基质蛋白紧密排列在囊膜内侧，是维持病毒形态的结构蛋白。基质蛋白内部包围着核衣壳，核衣壳由8个呈螺旋形排列的RNA-核蛋白复合物(RNP)构成，每个RNP由一个单股负链RNA外面包被着核蛋白(NP)形成，流感病毒基因组的8个负链RNA就形成了8个RNP。按照核蛋白NP和基质蛋白M抗原性的不同，流感病毒被分为A、B、C三型，也有学者称为甲、乙、丙三型。它们没有共同的抗原，但都能感染人，其中以A型流感病毒的流行规模最大。各型流感病毒又根据其病毒粒子表面的血凝素(HA，简写为H)和神经氨酸酶(NA，简写为N)抗原性的不同而被分为多种亚型，其中A型流感病毒中已经发现的H亚型有18种，N亚型有11种，H和N亚型可以形成不同的组合，如H1N1、H5N1、H3N2、H9N2亚型等。四次大流感的暴发和每年季节性流感的传播严重威胁着人类健康并造成重大经济损失，不时突现的高致病性禽流感时刻警示人类新一轮大流感暴发的潜在可能。流感病毒的血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)是病毒囊膜表面一个主要的抗原蛋白。HA蛋白最基本的功能是识别受体和膜融合，在病毒粒子包装和出芽过程中也起到一定的作用。HA分子与流感病毒的宿主范围、毒力、传播能力，以及人类新流行毒株或大流行毒株的出现有密切的关系，也是药物和疫苗设计主要的靶分子。流感病毒疫苗接种是当前人类预防流感的首选措施。然而，由于流感病毒血清型众多，一旦流感病毒疫苗株和流行株的抗原性不匹配，就会导致疫苗失效，无法提供相应的保护，无法对所有类型的流感病毒提供交叉保护。目前已经批准上市的疫苗都是病毒裂解疫苗，即灭活疫苗，如GSK公司生产的Quadrivalent和赛诺非巴斯德公司生产的都是多价的流感病毒裂解疫苗。该类疫苗需要先制备流感病毒活病毒，因此生产过程存在安全风险，而且生产成本也大大增加。目前尚无批准上市的流感病毒亚单位疫苗。
技术实现思路
本专利技术针对季节性流感病毒H3N2、2009年大流感的H1N1病毒和B型流感病毒B35和B51，我们设计了四价流感病毒亚单位疫苗，分别选取流感病毒株A/California/04/2009(H1N1)、A/HongKong/2014(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(B35)和B/Massachusetts/2/2012(B51)，分别构建其HA胞外区的杆状病毒表达质粒，通过昆虫细胞表达系统分别获得了可溶性的蛋白H1HA、H3HA、B35HA和B51HA，并利用分子筛和离子柱纯化获得了高纯度的三聚体目的蛋白，通过免疫小鼠实验和细胞中和实验，验证了该四价疫苗的有效性。本专利技术的第一个目的是提供一种四价蛋白质疫苗，包括四种蛋白，所述蛋白质分别命名为H1HA、H3HA、B35HA和B51HA，其氨基酸序列份为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示；这四个蛋白分别是在H1N1亚型流感病毒株血凝素、H3N2亚型流感病毒株血凝素、B型流感病毒株B35亚型血凝素、B型流感病毒株B51亚型血凝素的胞外区的前面加上了GP67信号肽序列，后面加上凝血酶酶切位点、fibritin的三聚体标签和6×His标签。所述蛋白质疫苗还包括佐剂，包括铝佐剂、MF59佐剂。所述蛋白质疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)构建重组质粒扩增编码流感病毒株A/California/04/2009(H1N1)、A/HongKong/2014(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(B35)和B/Massachusetts/2/2012(B51)的胞外区的核苷酸序列，加上GP67分泌信号肽，引导目的蛋白有效地分泌到细胞外；并加上一端编码凝血酶(Thrombin)酶切位点、来自于T4噬菌体次要纤维蛋白fibritin的三聚体标签和6×His标签的核苷酸序列，使得目的蛋白的C端带有凝血酶(Thrombin)酶切位点、来自于T4噬菌体次要纤维蛋白fibritin的三聚体标签和6×His标签；将所得片段连入到pFastBacTM1载体上，形成重组质粒(见图1)；(2)转化将重组质粒转化DH10BACTME.coli感受态，得到阳性重组菌；(3)提取Bacmid从阳性重组菌中提取Bacmid；(4)转染将Bacmid转染Sf9或Sf21细胞，获得P1代重组杆状病毒；(5)扩毒将P1代重组杆状病毒扩毒得到P3代重组杆状病毒；(6)蛋白表达纯化P3代重组杆状病毒感染Sf9或Sf21细胞，从细胞中分离纯化得到目的蛋白；(7)将4种目的蛋白按照特定比例，与佐剂混合，四价亚单位疫苗。本专利技术的第二个目的是提供所述四价疫苗在预防流感病毒方面的应用。本专利技术的第三个目的是提供编码所述四种蛋白的基因序列。本专利技术的第四个目的是提供表达四种蛋白的质粒和细胞系统。本专利技术的有益效果：本专利技术获得了一种流感病毒四价亚单位疫苗，该疫苗对小鼠有良好的保护作用，有预防流感病毒的应用价值。本专利技术采用杆状病毒表达系统来快速制备获得高纯度的三聚体蛋白质疫苗，所得疫苗免疫原性强，生产周期短，并且不存在任何的安全隐患，可以预防多种亚型的流感病毒。附图说明图1、表达质粒的构建示意图。图2、流感病毒H1HA蛋白的分子筛纯化结果；峰图上蛋白编号为从4到23。图3、流感病毒H3HA蛋白的分子筛纯化结果；图中横坐标上40ml之后，次要刻度线标记的蛋白的编号从左向右是1至20。图4、流感病毒B35HA蛋白的分子筛纯化结果；图中横坐标上40ml之后，次要刻度线标记的蛋白的编号从左向右是1至40。图5、流感病毒B51HA蛋白的分子筛纯化结果；图中横坐标上40～70ml之间，次要刻度线标记的蛋白的编号从左向右是1至19。图2～5中，沉淀表示收集蛋白时离心获得的细胞沉淀；M代表蛋白质分子量标记；数字分别代表峰图上相应位置的蛋白组分。图6、小鼠免疫血清对H1N1病毒的中和效果；图7、小鼠免疫血清对H3N2病毒的中和效果；图8、小鼠免疫血清对B35病毒的中和效果；图9、小鼠免疫血清对B51病毒的中和效果；图6～9中，横坐标是不同组别免疫小鼠的血清，Al-5-3表示四种HA胞外区蛋白各5μg与铝佐剂混匀后在第0、14和28天共三次免疫小鼠后分离的血清，Al-PBS-3表示PBS与铝佐剂混匀后在第0、14和28天共三次接种小鼠后分离的血清，MF-10-3表示四种HA胞外区蛋白各10μg与MF59佐剂混匀后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种四价亚单位疫苗，其特征在于，所述四价亚单位疫苗包括四种蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

【技术特征摘要】
1.一种四价亚单位疫苗，其特征在于，所述四价亚单位疫苗包括四种蛋白，其氨基酸序列分别为SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。2.权利要求1所述的四价亚单位疫苗，其特征在于，还包括佐剂。3.权利要求2所述的四价亚单位...

【专利技术属性】
技术研发人员：严景华，高福，马素芳，毛子安，毛卓玥，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，浙江普康生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11