一种含联合佐剂的结核亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种含联合佐剂的新型结核分枝杆菌亚单位疫苗，该疫苗以Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白为抗原成份，以铝和PolyIC为复合佐剂。本发明专利技术提供的佐剂能有效的提高机体对结核亚单位疫苗的细胞免疫应答，同时该佐剂与结核分枝杆菌抗原Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白联用，其免疫效果好于其它单一佐剂成分与Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白的配伍效果。

【技术实现步骤摘要】
一种含联合佐剂的结核亚单位疫苗
本专利技术涉及一种结核亚单位疫苗，具体涉及一种以Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白为抗原成份，以铝和PolyIC为复合佐剂的新型亚单位疫苗。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌引起的一种古老而漫长的感染性疾病。近几年，随着结核分枝杆菌多重耐药性菌株的增多和艾滋病的不断流行，使结核病死灰复燃。结核病已经成为危及全球的公共卫生问题。世界卫生组织于2012年公布了全球结核病状况报告，报告中显示2011年全球有870万新发结核病病例，140多万结核病死亡病例。从报告中可以看出结核病的发病、患病和死亡总数依然很高，造成的经济负担很重。我国是世界第二大结核病高负担国家，结核病患病人数多，并且每年因结核病导致的死亡人数也列于传染病死亡人数之首。世界卫生组织报道全球有1/3的人群感染了结核杆菌，即中国拥有4亿多的庞大的结核杆菌感染者。发病率高、耐药率高、因病死亡人数多、潜伏感染人群数量庞大，以上情况是中国结核病的疫情现状，由此可见中国的结核病疫情仍十分严重。针对此种疫情状况，有效地控制和预防结核病的发生有可能改变结核病流行现状。防控结核病最根本的途径可能还要依赖有效的结核病疫苗。到目前为止，卡介苗仍是预防结核唯一可用的疫苗。但在世界各国进行的数十次临床试验结果显示，卡介苗对成人肺结核的免疫保护力是0%～80%，对抑制潜伏期结核的复发毫无作用，因此研制新型结核疫苗十分必要。新型结核病疫苗不仅要对新生儿提供良好的预防作用，对于成年人和结核杆菌潜伏感染者也要起到预防作用。重组结核杆菌亚单位疫苗，特别是大肠杆菌中表达的亚单位疫苗，具有保护性抗原表位多、表达效率高、发酵工艺成熟、生成成本低、易于大规模生产及广泛使用和再次使用的特点。并且亚单位疫苗具有较高的安全性、易于被人们接受。但亚单位疫苗的主要缺点是免疫原性弱，往往需要有效的佐剂辅助才能引起理想的免疫应答。目前铝佐剂是应用最广泛的一类疫苗佐剂，但对于亚单位疫苗诱发理想的免疫应答反应效果欠佳。
技术实现思路
基于上述佐剂诱发免疫应答效果欠佳的问题以及对新型疫苗的迫切需求，本专利技术将具有不同特点的结核杆菌抗原相组合，并添加筛选出的适当的佐剂，制成了含联合佐剂的新型结合亚单位疫苗。为了实现本专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术选用Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白作为亚单位疫苗的保护性抗原以及选用铝和PolyIC作为复合佐剂。本专利技术中的Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白均属于结核杆菌保护性抗原，作为疫苗成分免疫人体后，刺激机体产生对这两种成分的特异性细胞免疫，当有结核杆菌进入或潜伏于人体时，这种较强的细胞免疫可以抑制结核杆菌的增值或促进其清除，对结核病的预防起重要作用。本专利技术将Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白联合使用均能发挥各自的抗原作用，它们组成的疫苗，适用于结合杆菌潜伏感染者的治疗。在亚单位疫苗中，佐剂是提高免疫活性的重要成分，本专利技术筛选出的新型联合佐剂为铝和PolyIC的联合佐剂。优选，Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白、铝佐剂和PolyIC佐剂的重量比为1～50:1～50:100～1000:1～100。更优选，Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白、铝佐剂和PolyIC佐剂的重量比为10:10:200:50。在应用时，一个剂量疫苗中含Ag85b蛋白1～50μg、ESAT6-CFP10融合蛋白1～50μg、铝佐剂0.1～1mg和PolyIC佐剂1～100μg，优选一个剂量疫苗中含Ag85b蛋白10μg、ESAT6-CFP10融合蛋白10μg、铝佐剂200μg和PolyIC佐剂50μg。铝佐剂可以是但不限于氢氧化铝、磷酸铝。PolyIC选自聚肌苷酸：聚胞苷酸，聚脱氧肌苷酸：聚胞苷酸，聚肌苷酸：聚脱氧胞苷酸或聚脱氧肌苷酸：聚脱氧胞苷酸。本专利技术中的PolyIC是一种高效的干扰素诱生剂，在体内可以产生类似病毒感染的免疫反应，可诱导CD4+和CD8+T细胞，增强细胞免疫和体液免疫应答。研究发现，PolyIC在猪体内能有效地诱导IFN-γ的产生，同时可以诱导单核细胞MHC-II和CD80/CD86的基因表达以及趋化因子、TLR-5、TLR-9、IL-12和p35的产生，证明其可以有效增强Th1型反应。铝佐剂是目前应用最广泛的一类疫苗佐剂，其安全性已被验证和认可，并且具有缓释作用，对疫苗的持续释放实现缓释给药有帮助，因此本专利技术的铝佐剂可以发挥上述优势。影响佐剂效果的因素很多，如与其配伍的蛋白种类与蛋白的配比等。本专利技术将铝和PolyIC联合Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白使用降低了联合佐剂两者的使用量，其中铝佐剂的使用量为0.2mg，PolyIC的量仅为50μg，上述剂量均远低于通常用量范围，却能达到较显著的增强免疫的效果，动物实验进一步证明，本专利技术疫苗可减轻Mtb感染豚鼠各脏器的病变程度，并有效抑制或杀死豚鼠体内潜伏感染的结核分枝杆菌。附图说明图1，Ag85b蛋白的SDS-PAGE电泳图；图2，ESAT6-CFP10融合蛋白的SDS-PAGE电泳图；图3-4，本专利技术的结核亚单位疫苗体内Ag85b和ESAT6-CFP10抗原特异性分泌IFN-γ的T细胞频率结果；图5-6，本专利技术的结核亚单位疫苗体内产生抗Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白抗体的结果；图7显示的是攻毒后实验组和对照组豚鼠脏器综合病变指数；图8显示的是攻毒后实验组和对照组豚鼠脾活菌数（log10）；图9显示的是攻毒后实验组和对照组豚鼠肺活菌数（log10）。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的前提下，对本专利技术所作的修饰或者替换，均属于本专利技术的范畴。实施例1Ag85b和ESAT6-CFP10两种抗原的制备1.1、试验方法1）Ag85b基因的扩增以及蛋白的纯化从Genbank查询结核杆菌H37Rv抗原ESAT6和CFP10的核酸和氨基酸序列，根据目的序列设计引物。表1首先以H37Rv全基因组为模板，引物见表1，对Ag85b在50μLPCR体系中进行扩增（ddH2O30.5μL、10×Buffer5μL、Taq酶0.5μL、dNTP4μL、上游引物4μL、下游引物4μL、DNA模板2μL）。扩增条件为：94℃10min；94℃45s，62.2℃45s，72℃1min，循环33次；72℃5min。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，进行胶回收，获得目的片段，经NdeI和EcoRI双酶切后在T4DNA连接酶催化下与pET30a克隆表达载体16℃连接过夜，转化DH5α，37℃培养过夜。挑选菌落于10mLLB培养基扩增，提取质粒后用上述内切酶消化，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后的阳性菌落经质粒测序进行进一步验证，并确认其基因序列正确。从测序正确的菌落中提取质粒转化BL21感受态细胞，获得重组菌，于LB液体培养基中培养重组菌，待菌液在600nm光密度（opticaldensity，OD）下的值达到0.6～0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.8mmol/L，诱导表达4h。离心经诱导表达的菌液，菌体沉淀用T-E缓冲液（Tris本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含联合佐剂的结核亚单位疫苗，其特征在于，其包括结核分枝杆菌抗原Ag85b蛋白和ESAT6?CFP10融合蛋白以及铝和Poly?IC联用的联合佐剂。

【技术特征摘要】
1.一种含联合佐剂的结核亚单位疫苗，其特征在于，其是由结核分枝杆菌抗原Ag85b蛋白和ESAT6-CFP10融合蛋白以及铝和PolyIC联用的联合佐剂组成，所述Ag85b蛋白、ESAT6-CFP10融合蛋白、铝佐剂和PolyIC佐剂的重量比为10:10...

【专利技术属性】
技术研发人员：王国治，卢锦标，都伟欣，陈保文，杨蕾，苏城，沈小兵，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：