【技术实现步骤摘要】
本公开涉及药物与诊断，尤其涉及一种梭状芽胞杆菌神经毒素效价检测方法。
技术介绍
1、肉毒杆菌神经毒素(botulinum toxins，bonts)和破伤风神经毒素(tetanustoxins，tent)是已知最强效的毒素，它们是两种不同疾病的病原体：肉毒杆菌中毒和破伤风。二者均属于同一毒素家族，被称为梭状芽孢杆菌神经毒素。这些毒素具有相同的分子结构，在细菌中产生为具有三个功能结构域的150kda原毒素。
2、bonts是由肉毒梭状芽孢杆菌在厌氧条件下产生的细胞外毒素，也是人类迄今为止发现的最致命生物毒素。人口服1μg/kg剂量的bonts即可致死，在2-36小时后可出现临床表现，其主要特征为全身无力并最终因呼吸衰竭而死亡。由于bonts中毒剂量小，潜伏期短，致死率高，而又易于制备获得，因此bonts需要重点监控。
3、根据抗原性可将bonts分为不同血清型。目前已确认并广泛认可自然界可产生7种血清型的bonts，按照字母顺序命名为a-g型。其中a、b、e、f型易引起人类肉毒中毒，c、d型易引起动物肉毒中毒，g型较为少见；每种血清型都因遗传变异而存在相应的亚型。
4、无论bonts的血清型如何，其均是由二硫键连接的约100kda重链(heavy chain，hc)和约50kda轻链(light chain，lc)组成。bonts进入神经元细胞首先通过hc的c末端受体结合结构域与其表面双受体结合，随后在这些受体的内吞过程中被共内化，bonts的构象变化发生变化，从而允许hc的n末端异位结构域形成
5、注射用bonts能够用于治疗斜视以及其他适应症。迄今为止，bonts已被广泛使用，用于治疗膀胱过度活动和间质性膀胱炎、颈椎肌张力障碍、偏头疼、上肢痉挛、下肢痉挛、三叉神经痛、抑郁症等。目前仅有两种亚型的肉毒杆菌神经毒素即bont/a1和bont/b1被批准用做治疗药物，两者在药物持续作用时间和效力方面略有不同。
6、目前，注射用bonts效价检测方法是小鼠ld50试验法(mld50)。该方法首先将bonts稀释为不同浓度，经由腹腔注入小鼠体内，4天内观察小鼠半数死亡数量来确定bonts效价，该方法被认为是检测肉毒毒素的“金标准”。小鼠bonts中毒最初的症状是蜂腰、后肢麻痹、呼吸困难，最后由于呼吸衰竭而死亡，引起严重的伦理问题。该方法需要可用于动物饲养的大型设施，并且需要训练有素的人员。此外，mld50结果变异系数大，检测通量低，不能满足对大批量产品放行检测的需求。
7、细胞学检测方法(cell based assay,cba)是唯一可以全面反映bonts中毒过程中毒素与细胞结合、内化、易位、切割四个步骤的方法。cba需要将细胞与bonts孵育一定时间，然后除去bonts后裂解细胞，最终定量测定bonts生物活性。bonts活性检测的特异性终点之一是snare切割，并且该终点可用于任何神经元细胞类型。
8、建立cba检测方法，首先需要筛选并获得对目标物敏感的细胞或细胞系。目前可用于cba检测的细胞主要包括连续细胞，原代神经元或经由人诱导多能干细胞(humaninduced pluripotent stem cells，hipscs)诱导分化而获得的成熟神经元。连续细胞可以大量生产，易于培养，容易改造且相对稳定。基于这些优点，多数研究以各种连续为模型建立检测目标物生物活性的cba。目前可获得的连续细胞包括人神经母细胞瘤sima，sk-n-sh，sh-5y5y以及be(2)-m17细胞，大鼠嗜铬细胞瘤pc-12细胞，小鼠脑神经瘤neuro-2a细胞等。但大多数连续细胞衍生于癌细胞有可能改变基因表达谱而导致目标待测物敏感性的改变。
9、有报道可采用大鼠背根神经节获取原代神经元进行cba检测。背根神经节的获取需要麻醉并处死动物，取其脊柱，用剪刀分别剪断两边连接椎体的椎弓根，去掉椎板，剥离马尾神经，然后用眼科镊拽出相应节段的背根神经节。上述操作容易损伤神经组织，背根神经节容易被血渍污染，寻找和分辨背根神经节困难等问题。此方法获得神经元仍需要杀死动物，并且神经元/非神经元比例在胚胎间不同，所获得的细胞多为混合神经元及胶质细胞，可导致活性检测结果出现显著差异。
10、此外，建立切割底物并检测底物改变以反应生物学活性的终端检测方法也非常重要。目前，最常用的蛋白质生物活性检测方法包括蛋白免疫印迹(western blot,wb)或酶联免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,elisa)，其可通过与目标物相互作用后的细胞裂解液中特定底物的裂解数量来确定目标物的生物活性。wb的检测通量低，检测结果需要根据拍摄的图片并运用软件分析比较，确定底物裂解数量，并不准确，仅仅为半定量的检测方法，重复性差，不能全面满足产品质量控制要求。而基于抗原抗体相互结合的双抗夹心elisa测定法被证明是稳定且灵敏度极高，并且易于验证。
11、有专利报道基于人神经肿瘤sima细胞并使用一种高度特异单克隆抗体，在msd(meso scale discovery)电化学发光(electrochemiluminescence，ecl)-elisa检测平台建立cba检测方法。此方法灵敏度高，也适用于质量控制，但sima细胞未表现出运动神经元样的特征，此外sima细胞源自癌细胞，其基因表达谱可能发生改变。有专利采用hipscs来源并分化的人神经元细胞进行固定，通过细胞膜渗透，利用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ap)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，hrp)在细胞内对snap25底物的总量snap25fl和切割量snap25197进行免疫学检测，从而确定bont/a在细胞中的生物活性。此方法避免了因裂解细胞不充分而导致目标蛋白量的减少，但需要对细胞进行固定，清洗，增加细胞通透性等，检测过程较为复杂，影响因素较多，重复性较差。
12、因此，建立高通量、准确且灵敏度高的bonts生物活性检测方法，在产品检本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种梭状芽胞杆菌神经毒素效价检测方法，其特征在于，所述检测方法利用细胞学检测方法进行，所述检测方法包括：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梭状芽胞杆菌神经毒素的血清型为A型。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述SNARE蛋白为SNAP25蛋白。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线的建立方法包括：制备至少三个浓度的对照品溶液，并参照待测样品溶液的处理方法处理后进行检测，建立标准曲线；
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述间接AlphaLISA检测的方法包括：
7.根据权利要求4-6中的任一项所述的检测方法，其特征在于，所述直接AlphaLISA检测的方法包括：
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的检测方法，其特征在于，所述诱导分化的前脑神经元细胞为HiPSCs诱导分化的前脑神经元细胞，包括γ-氨基丁酸神经元细胞和谷氨酸神经元细胞；
9.根
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述分化和成熟的方法包括：
...【技术特征摘要】
1.一种梭状芽胞杆菌神经毒素效价检测方法，其特征在于，所述检测方法利用细胞学检测方法进行，所述检测方法包括：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梭状芽胞杆菌神经毒素的血清型为a型。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述snare蛋白为snap25蛋白。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线的建立方法包括：制备至少三个浓度的对照品溶液，并参照待测样品溶液的处理方法处理后进行检测，建立标准曲线；
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨英超，杨克娜，马霄，朱衍志，张华捷，李小娟，李娅聪，王硕，袁力勇，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：
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