本发明专利技术涉及一种新型流感疫苗及其制备方法,本发明专利技术将流感病毒HA基因转染真核细胞后，真核表达修饰后的流感血凝素(HA)蛋白插入宿主细胞质膜上，再通过表面活化剂诱导细胞出芽的方法，产生了较大的展示流感病毒包膜糖蛋白的囊泡，经纯化和再一次加入表面活化剂处理后，使其变为尺寸均一、可控的、纳米级的拟态病毒囊泡。同时通过稳定表达HA的细胞株的建立和生物反应器的使用，本方法也适用于大规模的流感疫苗生产。本发明专利技术该方法简单易行，可以展示大多数的流感病毒(包括禽流感和猪流感)的血凝素蛋白，具有良好的普适性，有巨大潜力可用于新出现的高致死性流感病毒疫苗的设计。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种拟态流感病毒的纳米囊泡(VMV)，可以展示各种亚型的流感HA等抗原，其制备方法及所属纳米材料不仅可用于已知亚型的流感病毒的预防，还能用于防止新出现的未知流感病毒的爆发，属于生物医药材料以及纳米医学领域和预防医学领域。
技术介绍
流行性感冒病毒简称流感病毒，流感病毒包膜糖蛋白是由HA(haemmagglutinin)和NA (neuraminidase)组成的，由于RNA病毒易变异，HA和NA具有高度变异性，这导致流感在世界各地每年都有不同规模的小流行或是若干年一次的世界范围的大流行，流感不但给人类身体健康而且给世界经济发展带来极大地危害。世界卫生组织警告:一场全球性的流行性大流感将会导致200万-700万人死亡，尤其，近几年高致病性禽流感和猪流感在世界各地发生后，以惊人的速度在世界传播，由此导致爆发的地区蒙受巨大经济损失。因此，如何获得高效及安全的疫苗来防控及预防流感一直是各国科学工作者关注的课题。当前大部分的流感疫苗都是鸡胚生产的，生产的周期较长，同时禽流感病毒或其他流感病毒在鸡胚中生产过程中容易造成鸡胚死亡，降低了疫苗产量。此外，高致病性流感病毒的生产过程需要高安全等级的GMP环境，容易造成二次污染和病毒的泄露。
技术实现思路
本专利技术提出了一种新型的拟态流感病毒的纳米囊泡作为广谱的流感HA、NA等抗原的投递载体，它可以模拟流感病毒最外层的包膜及包膜蛋白部分，在表面活化剂A和B的作用下，形成纳米级的拟态病毒囊泡(VMV)，流感病毒抗原镶嵌于该拟态病毒囊泡上；该VMV可以进一步加入氢氧化铝佐剂或GPI糖苷佐剂，形成一种新的免疫复合物，以增强抗原的免疫原性。利用基因重组的方法在真核细胞中产生HA等病毒抗原，可以有效避免危险病毒的生产，有利于大规模的疫苗生产，满足世界范围内高致病性流感爆发时疫苗的需求。本专利技术的技术方案如下:—种普适性的流感疫苗，其包括可以模拟流感病毒最外层的包膜及包膜蛋白部分的纳米级的拟态病毒囊泡，流感病毒抗原镶嵌于该拟态病毒囊泡上；所述的囊泡为真核细胞经诱导出芽而得。所述流感病毒抗原包括各种流感病毒的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA、流感病毒抗原的各种表位中的至少一种。还可以为其它适合作为抗原的物质。所述的真核细胞包括T细胞、MDCK细胞、VERO细胞、S2细胞、昆虫细胞、胚胎干细胞、患者自体分离培养的细胞等各种真核细胞系中的至少一种。优选采用T细胞。在本专利技术中，囊泡中还可以被掺入表面活化剂，以控制该囊泡的纳米尺寸和均一性，和增加了 VMV的稳定性和柔韧性。其中，表面活性剂优选为曲拉通X-100和/或去氧胆酸钠盐。其优选使用浓度为0.01-0.1 %的去氧胆酸钠和0.01-0.1%曲拉通X-1OOo在本专利技术中，将流感病毒HA基因转染真核细胞后，真核表达修饰后的流感血凝素(HA)蛋白插入宿主细胞质膜上，经过嘌呤霉素筛选后获得稳定表达细胞株，再通过表面活化剂诱导细胞出芽的方法，产生了较大的展示流感病毒包膜糖蛋白的囊泡，经纯化和再一次加入表面活化剂处理后，使其变为尺寸均一、可控的、纳米级的拟态病毒囊泡。在本专利技术中，流感病毒抗原包括各种流感病毒的血凝素HA蛋白、神经氨酸酶NA、流感病毒抗原等各种表位。在本专利技术中，流感病毒抗原是通过疏水性跨膜肽段锚定于细胞质膜和VMV的脂质膜表面。本专利技术的又一技术方案为:—种普适性的流感疫苗的生产方法，包括如下步骤:I)将流感病毒基因转染真核细胞后，真核表达修饰后的病毒蛋白插入宿主细胞质膜上；2)筛选获得稳定表达细胞株；3)诱导细胞出芽，产生展示流感病毒包膜糖蛋白的囊泡。4)经纯化和处理，使其囊泡变为尺寸均一、可控的、纳米级的拟态病毒囊泡。其中，步骤I)基因转染的方法包括电转法、脂质体转染法、PEI转染、磷酸钙转染法、慢病毒或腺病毒转染中的至少一种。或是其它合适的方法。在本专利技术的较佳实施例中，步骤I)通过慢病毒转染病毒抗原基因，获得稳定表达HA的细胞株的方法，其中该慢病毒转染系统使用四质粒慢病毒系统，将PRRE、REV、VSVG,PLV四质粒转染真核细胞，转染后收集上清，获得慢病毒，再用慢病毒感染目标细胞，经筛选后，最终可以获得稳定表达的细胞株，用于进一步的生产VMV。在本专利技术中，步骤4)的处理方法为采用表面活化剂处理。在本专利技术的较佳实施例中，所述的表面活性剂为曲拉通X-100和去氧胆酸钠盐。在本专利技术的较佳实施例中，拟态流感病毒囊泡的制备方法，包括以下步骤:(I)取稳定表达HA在细胞质膜上的稳转细胞株(2)将0.015-0.02%的去氧胆酸钠加入到表达HA和NA的细胞中，混合30min后，再使用漩涡震荡器，高速旋转，目的是通过表面活化剂诱导细胞出芽的产生较大的VMV。(3)加入PMSF蛋白酶抑制剂后，大囊泡通过多次差速离心法进行纯化，先分别用800g、2000g、4000g离心5min(4°C )，去除细胞核和细胞器，然后使用25000g离心30min去除上清，从而获得较大的展示抗原的囊泡。为了获得更高纯度的囊泡，还可以再使用蔗糖密度梯度离心法或超滤膜过滤法进一步分离纯化较大的囊泡。(4)将上述纯化好的展示抗原的较大的囊泡在PBS溶液中吹打悬浮后，与0.045%的去氧胆酸钠和0.05%的曲拉通X-100在PBS溶液中混合30min后并超声15s，就可以产生尺寸均一的VMV，-80°C保存备用.一种普适性的流感疫苗中的VMV纳米颗粒的用途，该纳米囊泡可用于各种亚型的流感病毒HA等抗原的展示，包括猪流感病毒、人流感病毒和禽流感病毒的HA等抗原的投递。在本专利技术中，该VMV可以进一步加入氢氧化铝佐剂、GPI糖苷佐剂或其他佐剂，以增强投递抗原的免疫原性。在本专利技术中，VMV的制备方法可按如下步骤:(I)可以通过以下基因转染的方法包括电转法、脂质体转染法、PEI转染、磷酸钙转染法、慢病毒或腺病毒转染等，将流感病毒抗原基因HA或NA基因表达质粒转入真核细胞中，表达该流感病毒抗原蛋白在细胞的质膜上。(2)在转染48h后，使用2-3 μ g/ml的嘌呤霉素，对转染的真核细胞进行筛选，2-3星期后可获得多个团状细胞群，将其小心挑出并胰酶消化后，通过有限稀释法在96孔板中获得稳定表达抗原的单克隆细胞株。(3)往筛选出的细胞中加入0.015-0.02%的去氧胆酸钠，混合20_30min后，再使用漩涡震荡器，高速旋转，目的是通过表面活化剂诱导细胞出芽的产生较大的展示抗原的囊泡。(4)在加入PMSF蛋白酶抑制剂后，大囊泡通过多次差速离心法进行纯化，先分别用800g、2000g、3000g离心5min(4°C )，去除细胞核和细胞器，然后使用25000g离心30-45min去除上清，保留沉淀，从而获得较大的展示抗原的囊泡。(5)将该沉淀用PBS吹打起来，低功率超声分散后，使用蔗糖密度梯度离心进一步纯化:将VMV悬液以不超过离心腔50 %的空间体积的量上样，在O—55 %的蔗糖密度梯度下3000rpm/min离心3h (4°C )，检测280nm波长的紫外吸收峰，并收集下来，测定各组分HA等抗原的含量，来确定最佳组分。(6)浓缩后的大囊泡与0.045%的去氧胆酸钠和0.05%的曲拉通X-100在PBS溶液中混合30min后并超声15-30s，就可以产生尺寸均一本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种普适性的流感疫苗,其特征在于：包括可以模拟流感病毒最外层的包膜及包膜蛋白部分的纳米级的拟态病毒囊泡，流感病毒抗原镶嵌于该拟态病毒囊泡上；所述的囊泡为真核细胞经诱导出芽而得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘刚，张鹏飞，陈小元，陈毅歆，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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