烷基化流感疫苗制造技术

本发明专利技术除其它以外提供了基于含有一个或多个烷基化半胱氨酸残基的血凝素的改进的流感疫苗。具体地，本发明专利技术提供了含有用烷化剂处理的血凝素的流感疫苗及其制备方法。本发明专利技术提供的本发明专利技术的流感疫苗在储存时具有如通过单辐射免疫扩散(SRID)测定的保留效力的显著能力。

Alkylated influenza vaccine

The present invention provides, among other things, an improved influenza vaccine based on a hemagglutinin comprising one or more alkylated cysteine residues. In particular, the present invention provides influenza vaccines containing hemagglutinin treated with alkylating agents and methods of making the same. The present influenza vaccine of the present invention has a remarkable ability to retain retention potency as measured by single radiation immunodiffusion (SRID) when stored.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】烷基化流感疫苗相关申请的交叉引用本申请要求于2014年8月18日提交的美国临时申请62/038,753的优先权，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。背景流行性和大流行性流感每年发生，并且是全世界显著发病率和死亡率的原因。流感病毒是由两种表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)组成的高度多形性颗粒。HA在病毒穿透进入细胞期间介导病毒对宿主细胞的附着和病毒-细胞膜融合。因此，流感疫苗通常含有有效量的与疾病株匹配的HA，以诱导针对该疾病株的中和抗体的产生。已使用单辐射免疫扩散(Single-radial-immunodiffusion)(SRID)测定来测定流感疫苗中的血凝素(HA)含量，以及测量自1978年以来由食品药品监督管理局许可用于美国的流感病毒疫苗的效力。具体而言，SRID通过使用特异性抗HA抗体来测定流感疫苗中的HA含量。将疫苗样品施加至含有毒株特异性抗血清的琼脂平板上。通常将板在室温下于保湿室中孵育以允许抗原扩散。抗原与抗体的反应产生沉淀区(其呈沉淀环的形式)。可通过将样品的环直径与已知浓度的参照HA蛋白的直径进行比较来定量疫苗样品中的HA的量。所测试的疫苗的效力值可基于HA的量来获得。概述本专利技术除其它以外提供了具有保留在储存时通过SRID测量的效力的显著能力的改进的流感疫苗。本专利技术部分基于以下令人惊讶的发现：将HA抗原暴露于烷化剂(例如，2-碘乙酰胺(IOAM))导致在储存后通过SRID测量的HA效力的显著减少的损失。例如，如实施例部分所述，本专利技术人已证明，一些IOAM处理的HA抗原在储存6个月后显示如通过SRID测定的仅约1-5％的效力损失。不希望受任何特定理论束缚，预期HA效力随时间的损失的可能机制是分子间半胱氨酸键的形成。这些共价键在两性去垢剂(zwittergent)预处理时阻止HA玫瑰花结宏观结构解离，从而限制通过凝胶基质的迁移，导致与抗血清的相互作用减少。用烷化剂处理导致HA抗原的反应性半胱氨酸基团的烷基化，这阻止分子间二硫键形成。因此，本专利技术提供的烷基化HA抗原可在储存后更好地保持通过SRID测量的效力。由于SRID是用于测定流感疫苗中HA效力的最常用的测量方法之一并且是FDA和其它主要卫生局目前接受的唯一测定法，因此本专利技术允许确保在疫苗的寿命期间保留所需效力的疫苗的生产。在一个方面，本专利技术提供了包含含有一个或多个烷基化半胱氨酸残基的血凝素的流感疫苗。在一些实施方案中，血凝素含有1-5、1-4、1-3、2-5、2-4、2-3、3-5、3-4或4-5个烷基化半胱氨酸残基。在一些实施方案中，血凝素含有1、2、3、4或5个烷基化半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个烷基化半胱氨酸残基构成血凝素中存在的总半胱氨酸残基的约1-50％、1-40％、1-30％、1-20％或1-10％。在一些实施方案中，所述一个或多个烷基化半胱氨酸残基构成血凝素中存在的总半胱氨酸残基的约10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施方案中，基本上所有游离半胱氨酸残基被烷基化。在一些实施方案中，烷基化半胱氨酸残基包含甲基化半胱氨酸残基。在一些实施方案中，血凝素不具有非特异性的烷基化和/或遍在的甲基化。在一些实施方案中，通过质谱法测定烷基化半胱氧酸残基。在另一方面，本专利技术提供了包含用烷化剂处理的血凝素的流感疫苗。如本文所用，适用于本专利技术的烷化剂可以是能够烷基化半胱氨酸巯基的任何化合物。在一些实施方案中，烷化剂选自由以下组成的组：2-碘乙酰胺(IOAM)、碘乙酸、2-溴乙酰胺、谷胱甘肽溴乙酰胺、溴乙酸、1，3-丙磺酸内酯、甲基硫代磺酸甲酯(methylmethanethiosulfonate)、甲氧基羰基甲基二硫化物、马来酰胺、马来酰亚胺-PEG、乙烯基吡啶、N-乙基马来酰亚胺、甲苯磺酰基乙酰胺及其组合。在一些实施方案中，烷化剂是2-碘乙酰胺(IOAM)。在各种实施方案中，适用于本专利技术的血凝素是存在于加利福尼亚或所罗门毒株中的H1蛋白，存在于布里斯班、佛罗里达、俄亥俄、江苏或香港毒株中的B蛋白，和/或存在于维多利亚、珀斯、布里斯班或威斯康星毒株中的H3蛋白。在一些实施方案中，由本专利技术提供的流感疫苗是裂解流感病毒疫苗。在一些实施方案中，由本专利技术提供的流感疫苗是重组流感疫苗。在一些实施方案中，由本专利技术提供的流感疫苗是基于蛋的流感疫苗。在一些实施方案中，在动物细胞、植物细胞、酵母细胞、病毒细胞、真菌或藻类或合成细胞中产生由本专利技术提供的流感疫苗。在一些实施方案中，合适的动物细胞包括但不限于昆虫细胞、哺乳动物细胞和禽类细胞，诸如含胚卵、鸡胚细胞和鸭细胞系。在一些实施方案中，由本专利技术提供的流感疫苗是单价、二价、三价或四价流感疫苗。在一些实施方案中，由本专利技术提供的流感疫苗在约1-30℃的范围内的温度下储存约6个月后保留如通过单辐射免疫扩散(SRID)测定所测定的至少约90％(例如，至少约95％、96％、97％、98％、99％)的效力。在一些实施方案中，由本专利技术提供的流感疫苗基本上不含烷化剂。另一方面，本专利技术提供了一种烷基化血凝素的方法，其包括用烷化剂处理纯化的血凝素抗原或含血凝素的病毒颗粒的步骤。在一些实施方案中，适用于本专利技术的含血凝素的病毒颗粒是裂解病毒。在一些实施方案中，适用于本专利技术的纯化的血凝素抗原是纯化的表面抗原。在一些实施方案中，适用于本专利技术的纯化的血凝素抗原是纯化的重组血凝素蛋白。在一些实施方案中，适用于本专利技术的血凝素选自存在于加利福尼亚或所罗门毒株中的H1蛋白，存在于布里斯班、佛罗里达州、俄亥俄州、江苏或香港毒株中的B蛋白，或存在于维多利亚、珀斯、布里斯班或威斯康星毒株中的H3蛋白。在另一方面，本专利技术提供了制备流感疫苗的方法，其包括用烷化剂处理从基于蛋或基于细胞培养物的生产系统产生的流感病毒获得的病毒颗粒的步骤。在一些实施方案中，通过裂解流感病毒获得适用于本专利技术的病毒颗粒。在另一方面，本专利技术提供了制备流感疫苗的方法，其包括：从基于蛋或基于细胞培养物的生产系统中收获流感病毒；裂解流感病毒；用烷化剂处理裂解的流感病毒；和灭活处理的裂解流感病毒。在各种实施方案中，裂解步骤包括用去垢剂处理流感病毒。在一些实施方案中，合适的去垢剂选自(具有亲水性聚乙烯链的非离子表面活性剂)、牛磺脱氧胆酸钠、壬基苯酚乙氧基化物、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和/或脱氧胆酸钠。在一些实施方案中，去垢剂是(例如，X-100、N-101、720和/或X-200)。在一些实施方案中，合适的烷化剂选自由以下组成的组：2-碘乙酰胺(IOAM)、碘乙酸、2-溴乙酰胺、谷胱甘肽溴乙酰胺、溴乙酸、1，3-丙磺酸内酯、甲基硫代磺酸甲酯、甲氧基羰基甲基二硫化物、马来酰胺、马来酰亚胺-PEG、乙烯基吡啶、N-乙基马来酰亚胺、甲苯磺酰基乙酰胺及其组合。在一些实施方案中，合适的烷化剂是2-碘乙酰胺(IOAM)。在一些实施方案中，在基于蛋的生产系统中产生适于本专利技术的流感病毒。在一些实施方案中，在动物细胞、植物细胞、酵母细胞、病毒细胞、真菌或藻类中产生合适的流感病毒。在一些实施方案中，合适的动物细胞包括但不限于昆虫细胞、哺乳动物细胞和禽类细胞，诸如含胚卵、鸡胚细胞和鸭细胞系。在一些实施方案中，治疗步骤包括在1-30℃的范围内的温度下用所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种流感疫苗，所述流感疫苗包含含有一个或多个烷基化半胱氨酸残基的血凝素。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.18 US 62/038,7531.一种流感疫苗，所述流感疫苗包含含有一个或多个烷基化半胱氨酸残基的血凝素。2.根据权利要求1所述的流感疫苗，其中所述血凝素含有1-5个、1-4个、1-3个或1-2个烷基化半胱氨酸残基。3.根据权利要求1或2所述的流感疫苗，其中所述血凝素含有1个、2个、3个、4个或5个烷基化半胱氨酸残基。4.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中所述一个或多个烷基化半胱氨酸残基构成存在于所述血凝素中的总半胱氨酸残基的约1-50％、1-40％、1-30％、1-20％或1-10％。5.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中所述一个或多个烷基化半胱氨酸残基构成存在于所述血凝素中的总半胱氨酸残基的约10％、20％、30％、40％或50％。6.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中基本上所有游离半胱氨酸残基被烷基化。7.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中所述烷基化半胱氨酸残基包含甲基化半胱氨酸残基。8.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中所述血凝素不具有非特异性的烷基化和/或遍在的甲基化。9.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中通过质谱法测定烷基化半胱氨酸残基的数目。10.一种流感疫苗，其包含用烷化剂处理的血凝素。11.根据权利要求10所述的流感疫苗，其中所述烷化剂选自由以下组成的组：2-碘乙酰胺(IOAM)、碘乙酸、2-溴乙酰胺、谷胱甘肽溴乙酰胺、溴乙酸、1，3-丙磺酸内酯、甲基硫代磺酸甲酯、甲氧基羰基甲基二硫化物、马来酰胺、马来酰亚胺-PEG、乙烯基吡啶、N-乙基马来酰亚胺、甲苯磺酰基乙酰胺及其组合。12.根据权利要求10或11所述的流感疫苗，其中所述烷化剂是2-碘乙酰胺(IOAM)。13.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中所述血凝素是存在于加利福尼亚或所罗门毒株中的H1蛋白，存在于布里斯班、佛罗里达、俄亥俄、江苏或香港毒株中的B蛋白，和/或存在于维多利亚、珀斯、布里斯班或威斯康星毒株中的H3蛋白。14.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中所述疫苗是裂解流感病毒疫苗。15.根据权利要求1-13中任一项所述的流感疫苗，其中所述流感疫苗是重组流感疫苗。16.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中所述流感疫苗是基于蛋的流感疫苗。17.根据权利要求1-15中任一项所述的流感疫苗，其中在昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、病毒细胞、真菌或藻类中产生所述流感疫苗。18.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中所述流感疫苗是单价、二价、三价或四价流感疫苗。19.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中所述流感疫苗在1-30℃的范围内的温度下储存约6个月后保留如通过单辐射免疫扩散(SRID)测定所测定的至少约90％的效力。20.根据前述权利要求中任一项所述的流感疫苗，其中所述流感疫苗基本上不含烷化剂。21.一种使血凝素烷基化的方法，所述方法包括用烷化剂处理纯化的血凝素抗原或含血凝素的病毒颗粒的步骤。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述含血凝素的病毒颗粒是裂解病毒。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述纯化的血凝素抗原是纯化的表面抗原。24.根据权利要求21所述的方法，其中所述纯化的血凝素抗原是纯化的重组血凝素蛋白。25.根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述血凝素选自存在于加利福尼亚或所罗门毒株中的H1蛋白，存在于布里斯班、佛罗里达、俄亥俄、江苏或香港毒株中的B蛋白，或存在于维多利亚、珀斯、布里斯班或威斯康星毒株中的H3蛋白。26.一种制备流感疫苗的方法，所述方法包括用烷化剂处理从基于蛋的或基于细胞培养物的生产系统产生的流感病毒获得的病毒颗粒的步骤。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述病毒颗粒通过裂解所述流感病毒获得。28.一种制备流感疫苗的方法，所述方法包括：从基于蛋或基于细胞培养物的生产系统收获流感病毒；裂解所述流感病毒；用烷化剂处理所述裂解流感病毒；和使所述经处理的裂解流感病毒灭活。29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述裂解步骤包括用去垢剂处理所述流感病毒。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述去污剂选自牛磺脱氧胆酸钠、壬基苯酚乙氧基化物、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和/或脱氧胆酸钠。31.根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述烷化剂选自由以下组成的组：2-碘乙酰胺(IOAM)、碘乙酸、2-溴乙酰胺、谷胱甘肽溴乙酰胺、溴乙酸、1，3-丙磺酸内酯、甲基硫代磺酸甲酯、甲氧基羰基甲基二硫化物、马来酰胺、马来酰亚胺-PEG、乙烯基吡啶、N-乙基马来酰亚胺、甲苯磺酰基乙酰胺及其组合。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述烷化剂是2-碘乙酰胺(IOAM)。33.根据权利要求21-32中任一项所述的方法，其中在所述基于蛋的生产系统中产生所述流感病毒。34.根据权利要求21-32中任一项所述的方法，其中在动物细胞、植物细胞、酵母细胞、病毒细胞、真菌或藻类或合成细胞中产生所述流感病毒。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述动物细胞选自昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或禽类细胞。36.根据权利要求21-35中任一项所述的方法，其中所述处理步骤包括在1℃-30℃的范围内的温度下将所述纯化的血凝素抗原、所述含血凝素的病毒颗粒、所述病...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·米尔纳，J·海恩斯，S·豪泽，J·波利，
申请(专利权)人：圣诺菲·帕斯图尔公司，
类型：发明
国别省市：美国,US