流感疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种流感表面抗原疫苗，可由在动物细胞培养物上繁殖的流感病毒制得，其宿主细胞ＤＮＡ含量等于或小于每剂２５ｐｇ。本发明专利技术还涉及一种从在动物细胞培养物上繁殖的流感病毒制备表面抗原蛋白的方法，包括以下步骤：ａ．用ＤＮＡ消化酶处理包含完整病毒的细胞培养液，和ｂ．加入阳离子去污剂，然后分离表面抗原蛋白。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及由在动物细胞培养物上繁殖的流感病毒制得的流感表面抗原疫苗，和一种由在动物细胞培养物上繁殖的流感病毒制备表面抗原蛋白的方法。流感病毒的体长大约125nm，含有一个与核蛋白有关的核糖核酸(RNA)的核心，此核心被一层具有脂质双层结构的病毒被膜围绕。病毒被膜的内层主要由基质蛋白质组成，外层含有大部分来源于宿主的类脂物质。所谓的“表面蛋白质”，即神经氨酸酶(NA)和血细胞凝集素(HA)，表现为病毒体表的刺突。大部分市售的失活流感疫苗是所谓的“断裂疫苗”或“亚单位疫苗”。“断裂疫苗”是通过将整个流感病毒经可溶解浓度的去污剂处理，随后除去去污剂和大部分病毒的脂类物质制得。抗流感“亚单位疫苗”与“断裂疫苗”不同，不含有全部的病毒蛋白质。“亚单位疫苗”富含在接种时可以诱发所需的中和(因此保护)抗体的病毒的表面蛋白。大部分市售的流感疫苗由在鸡含胚卵上培育的流感病毒得到。然而一般认为，从卵来源制备的流感病毒作为疫苗有一些不利之处1.其制备过程由于卵的(微)生物学性质的不定性很易受破坏。2.如果遇到突然增加的需求，即在感冒严重流行或大流行的情况下，其制备过程由于不能得到大量合格的鸡蛋而完全缺乏产量的适应性。3.由此制备的疫苗对于已知对鸡和/或鸡蛋蛋白质过敏的人是禁忌的。对于这些问题的一种解决办法可以求助于从组织培养物制备流感病毒。此制备方法被认为具有许多优点1.组织培育的细胞系可以在完全确定的，不含(微)生物污染物的细胞库体系中得到，因此批次间的一致性大大增加，从而得到高质量的产品。2.在严重的流行病或传染病威胁的情况下，能得到充足疫苗的机会将增加。3.所得的流感病毒物质将更适合于给药途径的选择(口服、经鼻给药、吸入)。4.按WHO的观点，这项技术使每年一度的疫苗组合物的推荐可以被推迟(从二月中旬至三月中旬)，可以增进疫苗与流传菌株的匹配。然而，流感病毒的组织培养也存在一个重要问题，因为从传代细胞系中得到的遗传物质可能仍存在于疫苗中。这些问题形成一种危险，如不加以克服，将导致管理部门由于安全原因拒绝允许这些流感疫苗上市的请求。如美国食品药品管理局要求用于人体的生物技术产品每次服用剂量中含有的宿主细胞DNA不能超过100pg。因此，本专利技术提供一种制备流感病毒表面抗原的方法，由此制得的疫苗是安全的，每次服用剂量中所含的有害遗传物质不超过可被接受的数量，以符合管理部门提出的要求。无论如何，此方法被认为是理想的和令人惊喜地可以制备每一服用剂量所含宿主DNA量大大低于100pg的流感疫苗。相应地，本专利技术涉及一种从在动物细胞培养物上繁殖的流感病毒制得的流感表面抗原疫苗，其每次服用剂量中所含宿主细胞DNA等于或小于25pg。具体地说，本专利技术提供一种制备表面抗原蛋白的方法，用于通过在动物细胞培养物上繁殖的流感病毒制备这种低DNA的流感疫苗，它包括以下步骤a.用一种DNA消化酶处理含有整个病毒的细胞培养液，和b.加入阳离子去污剂，随后分离表面抗原蛋白。本专利技术的方法适用于制备含多种流感病毒株的疫苗，如人流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒、鸟流感病毒。本专利技术的动物细胞培养物可以含有初级细胞如鸡胚成纤维细胞(CEF)或传代细胞系如犬肾细胞(Madin Darby Canine KidneyCells(MDCK))、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和Vero细胞。可以直接在发酵罐中用DNA消化酶处理含完整病毒的发酵液，可以选择在细胞培养或病毒繁殖过程中进行。适合的DNA消化酶是脱氧核糖核酸酶(如按照EC 3.1.21和EC3.1.22分类的)和核酸酶(按照EC3.1.30和3.1.31分类的)。本专利技术所用适合的阳离子去污剂主要包括一种具有以下通式的化合物 其中R1、R2和R3是相同或不同的，各自代表烷基或芳基，或R1和R2，与相连的氮原子一起形成5或6元结构的杂环，同时R3代表烷基或芳基，或R1、R2和R3与相连的氮原子一起形成5或6元结构的杂环，在氮原子处不饱和，R4代表烷基或芳基，并且X代表阴离子。阳离子去污剂的例子是十六烷基三甲基铵盐，如溴化十六烷基三甲基铵(C.T.A.B.)，和十四烷基三甲基铵盐。合适的去污剂也可以是lipofectine、lipofectamine、DOTMA。阳离子去污剂可以补充以非离子去污剂，如吐温。经去污剂处理后表面抗原蛋白的分离可以包括以下步骤1.用离心或超滤等方法从表面抗原蛋白中分离核糖核蛋白微粒(体)，和2.通过去污剂与一种合适的树脂(如Amberlite XAD-4)的疏水性相互作用和/或通过超滤(透析)的方法，从表面抗原蛋白中除去去污剂。本专利技术的方法令人惊喜地得到一种含有极低量的来源于动物细胞的DNA的产物。一次剂量中所含DNA低于25pg，在许多样品中甚至很易达到低于每剂10pg。表面抗原蛋白可以被加工制成流感疫苗，如通过加入缓冲剂(如磷酸盐缓冲液)和/或与其它流感病毒血清型的抗原混合。进一步制备疫苗过程中可以选择性地经过表面抗原的浓缩。实施例1A.病毒繁殖1.在35℃条件下，将种子病毒和细胞在发酵罐中温育2天，使B/Yamagata型抗原的流感病毒在狗肾(Madin Darby CanineKidney(MDCK))细胞(ATCC CCL34)上繁殖。2.随后加入稀NaOH将发酵液pH提高到8.0，并加入Benzon核酸酶至最终浓度为每升1000单位(1μg)。3.在35℃条件下再进行4小时的温育。B.病毒分离1.发酵液通过一种滤孔为0.5μm的深度滤器(depth filter)过滤除去细胞碎屑。2.随后以截留分子量为300.000的滤膜超滤，将流感病毒浓缩和纯化。3.在浓缩物中加入蔗糖至终浓度为30％(w/v)，然后加入甲醛至终浓度为0.015％(w/v)。此混合物在2-8℃搅拌72小时。4.以磷酸盐缓冲盐水将病毒浓缩物稀释5倍，加到含有AmiconCellufine Sulphate的亲合柱上。以磷酸盐缓冲盐水洗涤除去杂质后，用1.5摩尔浓度氯化钠的磷酸盐缓冲盐水溶液洗脱病毒。洗脱物通过截留分子量为300.000的滤膜超滤而被浓缩并脱盐。C.亚单位分离1.加入非离子去污剂吐温-80至终浓度为300μg/ml，加入溴化十六烷基三甲基铵至终浓度为750μg/ml。将此混合物在4℃搅拌3小时，然后离心以从表面抗原蛋白中分离核糖核蛋白颗粒。2.上清液加入Amberlite XAD-4树脂在2-8℃搅拌过夜，除去去污剂。过滤除去Amberlite树脂，滤液随后通过0.22μm滤孔的滤器进行无菌过滤。在以上步骤中，以有效的试验方法对样品中的宿主细胞DNA含量进行分析，此试验基于用一种32P标记的犬DNA探针进行的狭线印迹杂交。各制备步骤后DNA的测定结果列于下表(此表中每剂量流感病毒疫苗中的DNA量表示为每50μg血细胞凝集素所含的微微克数(pg/50μgHA))。表 </tables>实施例2病毒的繁殖、纯化、灭活和裂解如实施例1所述。在病毒繁殖的后几个小时(步骤A2 and A3)，在繁殖培养基的pH(步骤A1)条件下发酵液经Benzon核酸酶处理，对于除去DNA产生相似的结果。脱氧核糖核酸酶I，虽然需要较高浓度，在去除宿主细胞DNA方面(步骤A1-A3)同样有效。本文档来自技高网...

【技术保护点】
流感表面抗原疫苗，由在动物细胞培养物上繁殖的流感病毒制得，其宿主细胞ＤＮＡ含量等于或小于每剂２５ｐｇ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：GJM冯沙兰伯格，R布兰德斯，
申请(专利权)人：杜菲尔国际开发有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]