本发明专利技术涉及GM-CSF-HER2重组蛋白及其方法和应用，具体涉及一种能够用于治疗肿瘤药物的GM-CSF-HER2重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；还包括其制备方法：将GM-CSF的基因序列和HER2的基因序列通过酶切克隆到质粒pCEP4中构建重组质粒，重组质粒转染人胚胎肾293细胞进行重组蛋白的表达，纯化收集所述的重组蛋白，该重组蛋白可以用于生产治疗肿瘤药物，如乳腺癌，本发明专利技术用基因工程方法将肿瘤特异性抗原和转导蛋白以及体外诱导DC细胞的关键试剂GM-CSF结合，制备出具有特异性且能延缓DC细胞寿命的融合蛋白，保证了DC细胞存活时间的延长以及特异性免疫应答的启动，GM-CSF-HER2重组蛋白避免了常规DC细胞培养中GM-CSF的额外添加，解决了培养周期中GM-CSF不足的缺点，并且共表达GM-CSF还可促进细胞毒作用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及GM-CSF-HER2重组蛋白及其方法和应用，具体涉及一种能够用于治疗肿瘤药物的GM-CSF-HER2重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；还包括其制备方法：将GM-CSF的基因序列和HER2的基因序列通过酶切克隆到质粒pCEP4中构建重组质粒，重组质粒转染人胚胎肾293细胞进行重组蛋白的表达，纯化收集所述的重组蛋白，该重组蛋白可以用于生产治疗肿瘤药物，如乳腺癌，本专利技术用基因工程方法将肿瘤特异性抗原和转导蛋白以及体外诱导DC细胞的关键试剂GM-CSF结合，制备出具有特异性且能延缓DC细胞寿命的融合蛋白，保证了DC细胞存活时间的延长以及特异性免疫应答的启动，GM-CSF-HER2重组蛋白避免了常规DC细胞培养中GM-CSF的额外添加，解决了培养周期中GM-CSF不足的缺点，并且共表达GM-CSF还可促进细胞毒作用。【专利说明】—种GM-CSF-HER2重组蛋白及其方法和应用本专利技术涉及GM-CSF-HER2重组蛋白及其方法和应用，具体涉及一种能够用于治疗肿瘤药物的GM-CSF-HER2重组蛋白及其制备方法、制作DC疫苗的方法和应用。肿瘤发生发展的根本原因之一是机体的免疫系统不能对其生长进行有效地控制，对此加以纠正，使机体的免疫系统能有效产生对肿瘤细胞的免疫排斥反应是近百年来人们一直研究的课题。肿瘤疫苗是该方面研究的主要内容，在众多的肿瘤疫苗中，根据抗原提呈细胞在肿瘤免疫中的重要作用而设计的树突状细胞(dendritic cells, DC)瘤苗是目前研究最热门方向。机体的免疫应答首先由抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)捕获、加工和处理抗原，再将抗原递呈给T、B淋巴细胞，从而引发一系列的免疫应答。树突状细胞(dendritic cell,DC)作为功能最强的APC，能激活静息型T细胞(naive T cell)，激发初始免疫应答，在体内发挥强大的免疫监视功能。肿瘤患者体内DC功能缺陷，不能有效递呈肿瘤抗原，导致免疫无能或免疫耐受，使肿瘤得以发生发展。应用DC瘤苗治疗肿瘤最引人瞩目的研究工作是应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏(pulsing) DC，然后将之回输或免疫接种至行瘤宿主，进行肿瘤免疫治疗，已证明该疗法能显著地诱导机体产生抗原特异性CTL，产生保护性免疫反应并能治疗已建立的荷瘤模型，这些研究为肿瘤的治疗提供了新的思路，将DC过继回输已在临床用于肿瘤病人的治疗，取得了一定疗效，表明该疗法具有一定的临床应用的可 行性。DC的抗原递呈功能是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的基础，DC的体外大量诱导扩增是DC瘤苗抗肿瘤免疫治疗的前提，DC瘤苗的体外构建是DC瘤苗的抗肿瘤免疫治疗的关键。随着DC体外诱导扩增技术的发展及分子生物学技术和基因工程技术应用于DC瘤苗构建方法的发现，使得产量增大、纯度提高、制备更容易等优点，更能满足实验和临床研究的需要。DC瘤苗用于肿瘤免疫治疗的实验和临床研究更趋成熟，DC瘤苗有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效方式。故本专利技术以构建肿瘤特异性抗原结合细胞因子等刺激DC细胞制备DC疫苗可有效激发体内的抗原特异性免疫反应，并用于肿瘤的预防及治疗。国外文献 Sipuleucel-T, Celestia S.Higano et al., nature reviews drugdiscovery，第9卷，第513~514页，20100731公开了一种自体细胞免疫疗法，其中公开了一种生产前列腺肿瘤的制备方法，其中将GM-CSF和可作为治疗性前列腺癌疫苗靶标的前列腺酸性磷酸(PAP)重组获得融合蛋白，激活DC，产生前列腺癌特异性的肿瘤疫苗。HER2,即原癌基因人类表皮生长因子受体2 (human epidermal growth factorreceptor-2, HER2)基因，具有酪氨酸激酶活性，是重要的乳腺癌诊断及预后判断因子。HER2蛋白的过表达，使其临床特点和生物学行为有特殊表现，其治疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别，因此J1ER2阳性或过表达的乳腺癌有别于其他类型的乳腺癌。针对现阶段应用常规方法所诱导的DC细胞具有抗原特异性不高以及过早凋亡等方面的不足。本专利技术提供了一种GM-CSF-HER2重组蛋白的制备方法，使诱导的DC细胞在抗原特异性和生存周期上都有了很大程度的提高，为后续的特异性免疫应答提供了很好的基础条件。本专利技术为肿瘤免疫治疗奠定了良好的基础。为实现上述目的，设计一种GM-CSF-HER2重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。一种制备上述重组蛋白的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成:a.将GM-CSF的基因序列和HER2的基因序列通过酶切克隆到质粒pCEP4中构建重组质粒，b.重组质粒转染人胚胎肾293细胞进行重组蛋白的表达，c.纯化收集所述的重组蛋白。将GM-CSF和HER2进行重组蛋白的融合具有可行性，且目的产物可进行DC疫苗的制备，因此将直接合成的2个蛋白的基因片段通过酶切位点链接到载体上面，再通过适合的表达系统进行蛋白的表达，整个过程涉及到了基因分子克隆重组技术，蛋白表达及纯化技术，所用技术方法均合乎该领域涉及的技术方法；由于GM-CSF-HER2重组蛋白属于外源重组蛋白，选择的表达载体及表达系统即PCEP4和人胚胎肾细胞293均适合外源重组蛋白的表达，选择正确的表达载体及表达系统可以提闻重组蛋白表达的成功率及表达量，也便于后续蛋白纯化。所述的酶切为:在GM-CSF的基因序列两端添加酶切点位Hind III和Not I，在HER2的基因序列两端添加酶切点位Xho I和BamH I。酶切位点的选择需根据实验目的，所结合外源基因片段的特性针对所选择的`载体所包含的多克隆位点而选择利于酶切结合的位点。在GM-CSF基因序列两端加酶切位点应为Hind III和Not I以及在HER2基因序列两端加酶切位点Xho I和BamH I，可利于重组蛋白基因的构建和表达。通过N1-NTA柱进行所述的分离纯化。由于GM-CSF-HER2重组蛋白带有6His标签，且需要在非变性条件下分离纯化，所以选择N1-NTA柱分离纯化。选择N1-NTA柱也是根据重组蛋白自身特性及纯化后的目的及使用性而决定的。所述重组蛋白可以用作生产治疗肿瘤的药物。所述的肿瘤为乳腺癌。一种所述重组蛋白制备DC疫苗的方法，其特征在于用所述的重组蛋白刺激诱导健康C57BL/6小鼠经由骨髓制备的DC细胞，制得DC疫苗。DC细胞可由外周血单个核细胞(PBMC)诱导而成，但是所占比例较小，利于动物实验所需的外周血更少，所以不利于DC的获得，选择健康BALB/C小鼠四肢骨骨髓制备成单细胞悬液，加入细胞因子体外诱导出小鼠DC细胞，利用GM-CSF-HER2重组蛋白可较大成功的诱导激活出DC疫苗。用于刺激诱导的重组蛋白的浓度为25~100ug/ml。用于刺激诱导的重组蛋白的浓度为25~50ug/ml。与常规利用肿瘤细胞裂解物诱导DC细胞的方法相比，本专利技术具有以下优点:⑴利用基因工程方法将肿瘤特异性抗原和转导蛋白以及体外诱导DC细胞的关键试剂GM-CSF结合，制备出具有特异性且能延缓DC细胞寿命的融合蛋白，保证了 DC细胞存活时间的延长以及特异性本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：张超，叶永清，苏国新，钱妮，
申请(专利权)人：上海柯莱逊生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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