一种具有酶活保护作用的重组蛋白制造技术

本发明专利技术提供一种了具有保护酶活性功能的重组蛋白。实验结果表明，本发明专利技术提供的重组蛋白能够在逆境条件下保护酶的活性，并且可减少酶发生聚集，防止其结构发生改变。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组蛋白及其在酶活保护中的应用。
技术介绍
蛋白在逆境胁迫条件下往往会降低或失去活性，比如冷冻和氧化等逆境是制约生物生长和发育的非生物胁迫因素。尤其是酶蛋白容易发生聚集或结构的其它改变而失活。因此，通过基因工程手段，得到能保护蛋白活性的重组蛋白，很有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有保护蛋白活性功能的重组蛋白。本专利技术发现，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的重组蛋白在逆境胁迫条件下可保护酶的活性，并能减少酶发生聚集和阻止结构发生改变。本专利技术对Dhp蛋白进行一级结构分析发现，Dhp蛋白显著的特点是含有一个亲水结构域(HD)，该结构域含有8个由11个氨基酸残基组成的基序，在两个基序之间含有连接肽。预测该结构域可能是Dhp蛋白发挥功能的核心区域。但目前未见耐辐射异球菌中Dhp蛋白亲水结构域在保护酶活和减少酶发生聚合方面的功能的研究报道，我们人工改造了HD结构域，将HD结构域进行加倍，即含有两个HD结构域(命名为2HD)，研究其在酶活保护中的作用。本专利技术表达了含两个完整亲水结构域的重组蛋白(2HD，16个保守基序)，研究2HD重组蛋白在逆境胁迫条件(液氮反复冻融和H2O2冲击)下对酶的保护作用。本专利技术通过以下研究得到上述结果：1、Dhp蛋白亲水结构域分析：围绕Dhp蛋白的抗逆保护功能，本研究对该蛋白的一级结构分析发现：Dhp蛋白由298个氨基酸组成，分子量为30.9kDa，富含亲水性氨基酸，亲水氨基酸含量为61％，是一类亲水蛋白。与其它典型的亲水蛋白质比较，Dhp蛋白显著的特点是含有一个亲水结构域(HD)，该结构域亲水氨基酸含量为63.9％，HD亲水结构域含有8个由11个氨基酸残基组成的保守基序(motif)，两个基序之间含有7aa或11aa的连接肽，预测该结构域可能是Dhp蛋白发挥功能的核心区域。2、2HD重组蛋白表达载体的构建：1)以本实验室保存的重组质粒pET28a-dhp为模板，通过PCR扩增出目的基因(hd)；2)将hd基因连接于pET28a表达载体上，构建完整x基因重组质粒pET28a-hd；3)将导入hd基因的重组质粒pET28a-hd转入受体大肠杆菌BL21中，获得工程菌株BL-hd(见实施例2)。用限制性内切酶NdeI和EcoRI酶切pET28a-hd，同时用EcoRI和XhoI酶切hd基因片段。方法同上，将hd基因片段连接到pET28a-hd上，获得BL-2hd重组表达载体，经DNA测序正确后于-80℃冰箱保存。3、2HD重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达与纯化:实验证实，在IPTG浓度为0.5mM、诱导温度为16℃的条件下，可溶性目的蛋白条带最清晰，蛋白表达量最大。用不同浓度咪唑洗脱液对树脂上的融合蛋白进行洗脱并收集洗脱液，经SDS-PAGE电泳分析，确定最合适的咪唑浓度洗脱液。实验结果显示，2HD蛋白在200mM咪唑处获得较纯的蛋白(见实施例3)。4、2HD重组蛋白在逆境胁迫条件下对苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的保护作用：1)未加入待测样品的MDH和LDH酶溶液为对照组，分别进行胁迫处理(液氮反复冻融和H2O2冲击)，测定MDH和LDH酶的活性；2)分别取10μL胁迫处理后的样品，分别加入到600μL的反应液中反应1min，测定A340的吸收，根据A340吸收值的变化计算酶活变化率；此实验表明：2HD重组蛋白在逆境胁迫条件下能够保护MDH和LDH酶活，减少酶活损失(见实施例4)。5、2HD重组蛋白在液氮反复冻融胁迫条件下可减少乳酸脱氢酶(LDH)发生聚集。1)未加入待测样品的LDH酶溶液为对照组，分别经反复冻融处理1、2、3次，测定LDH的聚合度；2)取200μL胁迫处理后的样品，测定A340的吸收，根据A340吸收值的变化计算LDH的聚合度；此实验表明：该重组蛋白在液氮反复冻融条件下能减少LDH发生聚集(见实施例4)。6、2HD重组蛋白在液氮反复冻融胁迫条件下可防止乳酸脱氢酶(LDH)结构发生改变。1)未加入待测样品为对照组，样品依次反复冻融1次、2次和3次。2)样品处理完后，立即加入终浓度为5μM的荧光探针ANS。使用荧光分光光度计测定样品在410nm到590nm之间的荧光发射光谱(见实施例4)。本专利技术的效果体外酶活实验结果表明，2HD重组蛋白在胁迫条件下均能够保护苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性。此外，通过测定蛋白聚合度及ANS荧光分析实验表明，在反复冻融处理条件下，2HD蛋白可阻止LDH发生聚集，防止LDH结构发生改变。表明：由11个氨基酸残基组成的基序及基序数量与其对酶保护能力有关。附图说明：图1是HD亲水结构域和8个基序在Dhp蛋白中的位置；图2是HD结构域及序列比对示意图，其中：a为Dhp蛋白HD结构域简图，其中第104-263位氨基酸残基为HD结构域；b为HD亲水结构域氨基酸序列比对，左边方框内为HD结构域的8个由11个氨基酸组成的基序，右边方框内为7个连接肽。对于基序序列分析发现，位于第3、4、6、7、8、10以及第11位置上的氨基酸为亲水性氨基酸(黑色加粗表示)，亲水氨基酸含量为61.36％，其他位置上的氨基酸为疏水性氨基酸。对于11个氨基酸组成的连接肽分析发现，位于第3、4、6、10以及11位置上的氨基酸为亲水性氨基酸(黑色加粗表示)。图3是2HD亲水结构域重组示意图：全长HD蛋白(第104-263位氨基酸残基序列)、重组2HD蛋白(含有两倍的全长HD蛋白序列)；图4是2HD重组蛋白可保护液氮反复冻融条件下苹果酸脱氢酶(MDH)的活性；图5是2HD重组蛋白可保护不同浓度H2O2条件下苹果酸脱氢酶(MDH)的活性；图6是2HD重组蛋白可保护液氮反复冻融条件下乳酸脱氢酶(LDH)的活性；图7是2HD重组蛋白保护不同浓度H2O2条件下乳酸脱氢酶(LDH)的活性；图8是2HD重组蛋白可防止液氮反复冻融条件下LDH发生聚集；图9是2HD重组蛋白可阻止液氮反复冻融下LDH结构发生改变。序列表说明SEQ ID NO.1是编码2HD重组蛋白的基因的核苷酸序列；SEQ ID NO.2是2HD重组蛋白的氨基酸序列。具体实施方式实施例1 Dhp蛋白HD亲水结构域分析Dhp蛋白显著的特点是含有一个亲水结构域(HD)，该结构域亲水氨基酸含量为63.9％，HD结构域含有8个由11个氨基酸残基组成的基序，在两个基序之间含有连接肽，共7个连接肽，分别含有4个由11个氨基酸残基组成和3个由7个氨基酸残基组成。如图1所示，对11个氨基酸残基组成的基序分析发现，位于第3、4、6、7、8、10以及第11位置上的氨基酸为亲水性氨基酸(亲水氨基酸含量为61.36％)，其他位置上的氨基酸为疏水性氨基酸。基序序列特点为[ΦΦE/QXΦKE/QKΦXE/D/Q]，其中Φ为疏水氨基酸。对于11个氨基酸组成的连接肽分析发现(亲水氨基酸含量为55.38％)，如图2所示，位于第3、4、6、10以及11位置上的氨基酸为亲水性氨基酸，对于7个氨基酸组成的连接肽分析发现，第2、4、6和第7位氨基酸为亲水氨基酸。通过序列比对分析发现，7个连接肽中保守氨基酸为缬氨酸(V)，推测该位点在连接肽中可能起着重要作用。实施例2 2HD重组蛋白表达载体的构建为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述重组基因在保护蛋白活性中的应用。3.权利要求2所述的应用，所述保护蛋白活性是对酶的保护作用。4.权利要求3所述的应用，所述对酶的保护作用，是在逆境胁迫条件下保护酶的活性，并减少酶发生聚集和阻止酶结构发生改变。5.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王劲，林敏，平淑珍，左开井，刘盈盈，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11