本发明专利技术公开了一种金钱鱼黄体生成素LH基因、金钱鱼LH重组蛋白及应用；具体而言，是由金钱鱼黄体生成素LH基因通过原核表达系统诱导表达得到的金钱鱼LH重组蛋白及其应用，不仅获得了金钱鱼黄体生成素LH基因的cDNA序列全长，还通过原核表达获得了金钱鱼LH重组蛋白，通过亲和柱纯化，获得纯的LH重组蛋白，以应用于鱼类体外注射来促进鱼类性腺发育，进而使鱼类性腺发育表现同步性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种金钱鱼黄体生成素LH基因的cDNA序列，还有由其通过重组质粒的构建、原核表达系统诱导表达得到的金钱鱼LH重组蛋白的纯化及应用。
技术介绍
金钱鱼(Scatophagusargus)又名金鼓鱼，隶属鲈形目(Perciformes)，金钱鱼科(Scatophagidae)，分布于我国东海和南海海域，为一种兼具观赏性的优质经济鱼类。金钱鱼为广盐性鱼类，在盐度极高的海区中有分布，在纯淡水中也能很好的生长与存活，可以直接从35‰的海水转移到淡水生活，无需进行淡化驯养，其罕有的对盐度超强的适应性使其非常适合作为研究硬骨鱼类生殖与生长的材料。研究金钱鱼的金钱鱼精子发生机制对于海水经济鱼类的淡化养殖非常有意义。了解海水鱼类繁育过程中的机体变化与环境适应，对于提高海水鱼类繁殖和生长性能，对于水产养殖发展具有重要意义。黄体生成素又称促黄体素(luteinizinghormone，LH)。垂体前叶嗜碱性细胞所分泌的激素。为糖蛋白。分子量约30000。化学结构：为糖蛋白，由α和β两个亚基肽链以共价键结合而成。在有卵泡刺激素存在下，与其协同作用，刺激卵巢雌激素分泌，使卵泡成熟与排卵，使破裂卵泡形成黄体并分泌雌激素和孕激素。刺激睾丸间质细胞发育并促进其分泌睾酮。故又称间质细胞促进素。LH、FSH和人绒毛膜促性腺激素(HCG)都属于糖蛋白家族，LH的结构和功能与HCG相似，两种激素通过相同的受体发挥作用，但其半衰期很短，约30分钟，在血液中波动范围较大；而HCG有较长的半衰期，并且与受体结合更加稳固，容易被放免法所测定，所以经常用于临床和实验室研究。虽然促黄体生成素(LH)对人类的不孕不育治疗有了广泛的应用，但是对鱼类的研究与应用还比较少。黄体生成素的功能：(1)促进雌激素和孕酮的合成。(2)触发排卵：在切除腺垂体的病人，当用各种方法使卵泡发育到一定阶段后，人工给予LH即可导致排卵。LH引起排卵的机制可能是由于溶蛋白酶，淀粉酶，透明质酸酶的活性增加，导致卵泡壁的结缔组织分解而造成的。动物实验表明：在LH作用下产生的孕酮可以触发排卵酶的形成及释放。在LH作用下，成熟的卵泡分泌前列腺素。(3)促进黄体的产生：成熟的卵泡中的粘膜细胞在没有LH存在时，也会自然地黄体化，但未成熟的粒膜细胞，只有加入LH，才能黄体化。(4)LH对卵巢的其他作用：增加卵巢的血流量，增加鸟氨酸脱羚酶的活性，降低卵巢组织内胆固醇浓度。LH能促进Leydig细胞增殖和分化促进攀酮的生成，同时，精囊和前列腺也增生。LH在促使家畜性成熟提前、诱导泌乳乏情期的母畜发情、提高公畜精液品质、治疗母畜卵巢疾病和胚胎移植中的供体超数排卵等领域的应用中已经得到了深入的分析和总结，近年来又对胚胎移植与超数排卵(MOET)、卵母细胞的体外成熟(IVM)和体外受精(IVF)进行了深入研究和探索。使我们进一步了解了LH在动物繁殖育种中的应用：(1)促使家畜性成熟提前：某些家畜的繁殖具有季节性，如果出生较晚，性成熟时有可能错过繁殖季节，接近性成熟的家畜孕酮处理，配合使用LH，可使它们提早发情配种；(2)诱导泌乳乏情期的母畜发情：LH处理，可诱导泌乳乏情期的母畜发情和配种，缩短胎间距，提高母畜的繁殖效率；(3)提高公畜精液品质：公畜精子密度不足或精子活力差可致母畜不孕，应用LH和FSH治疗，可提高精子密度，改善精液品质；(4)治疗母畜卵巢疾病：LH对卵巢机能不全，发育停滞或交替发育均有较好疗效；(5)超排处理：在胚胎移植工作中，为了获得大量的卵子和胚胎，常用LH对供体动物进行处理，使其卵泡大量发育成熟和排卵；(6)卵母细胞的体外成熟和体外受精。家畜卵母细胞体外成熟和促性腺激素有着密切的联系。总之，黄体生成素因其广泛而奇特的生物学功能，在水产养殖产业和畜牧业甚至人类疾病治疗等领域有着广泛和诱人的前景。现有技术存在的问题：随着水产养殖规模不断地扩大，为了稳定的保证数量的生产模式，确保繁殖、生长的效率，很多药物投入到生产行业中，这无疑会对环境以及人体造成一定伤害。近年来随着生物学技术的快速进展，使得对鱼类精子发生相关基因的认识取得了长足的进步。RT-PCR技术、原位杂交技术、减除杂交技术、差异显示技术、EST微阵列技术的应用获得了许多与精子发生及成熟相关的基因，促进了对精子发生分子机理的认识。但是，精子发生有大量基因表达，并且这些基因表达是呈阶段特异性的，具有严格的时、空调控关系，用睾丸和精子mRNA探测一块克隆EST微阵列已经说明了精子发生的复杂性，在精子发生相关基因的研究中尚存在许多未知领域。基因的发现及其功能与关系的阐明是将来研究精子发生分子机理的核心任务，目前鱼类对于调控精子发生的特异基因研究尚处于起步和探索阶段。进一步筛选、鉴定和克隆精子发生过程特异表达基因，对于了解精子发生、减数分裂和分化变态的分子及其调控机制十分重要。由于生精细胞的发育需要严格的特殊环境，缺少体外培养模型，长期制约着精子发生分子机理的研究。但近年来随着生物学技术的快速进展，使得对精子发生相关基因的认识取得了长足的进步。减除杂交、差异显示技术的应用获得了许多与精子发生及成熟相关的基因。鉴定调节精子发生的关键基因以及阐明其功能是将来研究精子发生分子机理的核心任务，完善对金钱鱼精子发生机制的研究，为研究鱼类精子发生的分子机制等提供基础数据，从而更好的指导生产实践。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种金钱鱼黄体生成素LH基因、金钱鱼LH重组蛋白及应用；具体而言，是由金钱鱼黄体生成素LH基因通过原核表达系统诱导表达得到的金钱鱼LH重组蛋白及其应用，不仅获得了金钱鱼黄体生成素LH基因的cDNA序列全长，还通过原核表达获得了金钱鱼LH重组蛋白，通过亲和柱纯化，获得纯的LH重组蛋白，以应用于鱼类体外注射来促进鱼类性腺发育，进而使鱼类性腺发育表现同步性。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术涉及一种金钱鱼黄体生成素LH基因，其cDNA序列包括如SEQIDNO：1所示的碱基序列。第二方面，本专利技术涉及一种金钱鱼LH重组蛋白，所述重组蛋白包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。编码该重组蛋白的基因序列如SEQIDNO：1所示。第三方面，本专利技术还涉及一种前述的金钱鱼LH重组蛋白的制备方法，获取前述的金钱鱼黄体生成素LH基因的cDNA序列全长，通过原核表达获得金钱鱼LH重组蛋白。优选的，所述获取包括如下步骤：S1、利用Trizol提取法，利用金钱鱼性腺进行RNA提取，再通过反转试剂盒进行cDNA的合成；S2、根据步骤S1合成得到的cDNA保守区设计引物，利用RT-PCR和RACE技术，克隆获得金钱鱼LH基因序列全长。优选的，所述克隆引物对为3′LH1、3′LH2和5′LH1、5′LH2。其碱基序列分别依次如SEQIDNO：3-6所示。优选的，所述原核表达包括如下步骤：A1、金钱鱼黄体生成素LH基因的cDNA序列与pGEM-TEasy载体连接后，转化至DH5α感受态细胞，扩增培养；离心收集，抽提含有目的基因(LH基因)和pGEM-TEasy载体的质粒；A2、根据pET-28a+载体选择酶切位点XhoI(158)，NdeI(238)，分别对步骤A1抽提得到的质粒DNA进行双酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种金钱鱼黄体生成素LH基因，其cDNA序列包括如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。
【技术特征摘要】
1.一种金钱鱼黄体生成素LH基因，其cDNA序列包括如SEQIDNO：1所示的碱基序列。2.一种金钱鱼LH重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。3.一种如权利要求2所述的金钱鱼LH重组蛋白的制备方法，其特征在于，获取如权利要求1所述的金钱鱼黄体生成素LH基因的cDNA序列全长，通过原核表达获得金钱鱼LH重组蛋白。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述获取包括如下步骤：S1、利用Trizol提取法，利用金钱鱼性腺进行RNA提取，再通过反转试剂盒进行cDNA的合成；S2、根据步骤S1合成得到的cDNA保守区设计引物，利用RT-PCR和RACE技术，克隆获得金钱鱼LH基因序列全长。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述原核表达包括如下步骤：A1、金钱鱼黄体生成素LH基因的cDNA序列与pGEM-TEasy载体连接后，转化至DH5α感受态细胞，扩增培养；离心收集，抽提含有目的基因(LH基因)和pGEM-TEasy载体的质粒；A2、根据pET-28a+载体选择酶切位点XhoI(158)，NdeI(238)，分别对步骤A1抽提得到的质粒DNA进行双酶切；回收有效片段；A3、纯化；将目的基因和质粒的回收产物连接，连接产物导入BL-21表达感受态细...
【专利技术属性】
技术研发人员：王武，张俊彬，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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