一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括包被了猪瘟抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。本发明专利技术以杆状病毒表达系统获得的CSFV‑E2蛋白作为包被抗原，利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对CSFV‑E2蛋白进行标记，获得酶标抗原，具有无毒性等优点，抗原的产生和纯化，相对于全病毒来说重组蛋白较容易获得。本试剂盒采用双抗原夹心法，具有较高的特异性和敏感性，并且大大缩短了检测时间。对解决大批量样品猪血清中的猪瘟病毒抗体检测具有重要的现实意义，通过对猪群抗体水平的检测，可以实时监控猪群的整体免疫效果，为该病的诊断、检测和监测等提供了有力的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒
本专利技术涉及免疫检测
，具体是涉及一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒。
技术介绍
猪瘟(CSFV)是严重危害我国养猪业的一个猪病，抗体检测是防控的关键，然而目前我国CSFELISA抗体检测试剂盒主要依赖进口，成本极高。CSFELISA抗体检测试剂盒在国内市场多以进口产品为主，成本极高。近年来虽然有多家公司开发或转化生产了一些诊断试剂盒，但其稳定性，可重复性和敏感性仍无法与进口产品相媲美，而且多未获得管理部门的正式批文。目前进口试剂盒多属于竞争ELISA，是采用全病毒作为抗原和HRP标记的单克隆抗体作为二抗，相比于本专利技术，全病毒和单克隆抗体的制备与获得工艺更加复杂，耗时更久，成本更高，并且在检测的过程中，其抗原抗体的孵育时间至少需要两个时间或者过夜孵育，检测时间较长，不利于进行大批量的样品检测。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是提供一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，以杆状病毒系统表达的CSFV抗原为基础，灵敏度高、特异性和稳定性好，可用于猪瘟抗体的快速检测。本专利技术的技术方案是：一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括包被了猪瘟抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。进一步地，在上述方案中，所述包被了猪瘟抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是通过杆状病毒表达系统获得的CSFVE2蛋白，所用包被液是碳酸盐缓冲液，所用封闭液是含2％明胶的PBST。有前期研究结果表明，在CSFV的结构蛋白中，E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白，具有更好的活性和免疫原性，能诱导机体产生CSFV的中和抗体，保护机体免受强毒的攻击，因此E2糖蛋白，既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象，也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原。本专利技术将CSFV-E2蛋白克隆入杆状病毒表达载体系统中，转染昆虫细胞，获得体外表达的外源蛋白，并将该蛋白作为诊断抗原建立ELISA抗体检测方法，与原核表达的蛋白作为包被抗原相比，杆状病毒表达系统所表达的外源蛋白更加接近真实的天然蛋白的空间构象和功能，利用该系统表达的蛋白与猪血清中抗体的结合更加具有特异性和敏感性，可作为理想的包被抗原蛋白。进一步地，在上述方案中，所述酶标抗原是利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对CSFV-E2蛋白进行标记。进一步地，在上述方案中，所述阴、阳性对照血清通过IFA试验鉴定获得。进一步地，在上述方案中，所述20X浓缩洗涤液配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-202mL、蒸馏水20mL。进一步地，在上述方案中，所述底物缓冲液A配方：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8gNa2HPO4·12H2O，吐温-20100μL，蒸馏水1000mL，pH5。进一步地，在上述方案中，所述底物液B配方：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g柠檬酸，蒸馏水1000mL，pH2.4。进一步地，在上述方案中，所述终止液配方：2M浓硫酸。本专利技术还提供了一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒的使用方法：S1：待测血清经前处理后备用；取出试剂盒，在室温下平衡30分钟备用；20X的浓缩洗液按所需量稀释成1X备用，阴、阳性对照血清或初乳各做两个重复，加入100μL1:1001X浓缩洗液稀释的待检血清，37℃孵育1h；倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入按1:200稀释好的酶标抗原100μL，37℃孵育30分钟；倒出孔中的液体，用PBST洗板5次，拍干；取底物缓冲液A和底物液B等体积混匀，每孔加100μL，在暗处显色10-15分钟，每孔加入50μl的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值；S2：结果计算，用建立的双抗原夹心ELISA方法检测40份阴性血清，血清不稀释，100μL/孔，每份血清重复2孔，按照以上已确立的ELISA程序进行ELISA测定，读出D450值，计算40份血清的D450平均值和标准差；S3：根据统计学原则，D450值平均数+3×标准方差时，可以在99.9％的水准上判定为阳性，因而设定阴阳性临界值等于阴性血清的D450值平均数+3×标准方差，求得阴阳性临界值0.4，在规定的实验条件下，其D450值大于临界值，即待检血清样本D450﹥0.4，判为阳性，反之为阴性。进一步地，所述猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒的的检测原理是：酶标板上的每个孔均包被有相同量的抗原，加入待测血清后，固相包被抗原和待测血清中的抗体反应，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去未结合物质，再加入酶标抗原，固相免疫复合物上的抗体与酶标抗原结合，彻底洗涤未结合的酶标抗原，加入底物液(即显色液A液)和显色液(即B液)，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明血清中抗体水平低；反之，当待测血清中抗体含量高时，则所测的OD值高，显色反应深。本专利技术的有益效果是：本专利技术以杆状病毒表达系统获得的CSFV-E2蛋白作为包被抗原，利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对CSFV-E2蛋白进行标记，获得酶标抗原。以此作为开发的新型CSFELISA抗体检测试剂盒能够替代国外同类产品。相比完整的CSFV，重组的结构蛋白具有无毒性等优点，因此，实验无须在专门的实验室中进行。更重要的是，抗原的产生和纯化，相对于全病毒来说重组蛋白较容易获得。囊膜E2蛋白作为CSFV主要抗原蛋白，包含许多在CSFV毒株中高度保守的抗原区域。而在ELISA检测中，针对BVDV和BDV的抗体检测中存在交叉反应。但这一情况，在使用重组E2蛋白代替全病毒后降低。本试剂盒采用双抗原夹心法，具有较高的特异性和敏感性，并且大大缩短了检测时间。本专利技术对解决大批量样品猪血清中的猪瘟病毒抗体检测具有重要的现实意义，通过对猪群抗体水平的检测，可以实时监控猪群的整体免疫效果，为该病的诊断、检测和监测等提供了有力的工具。附图说明图1是本专利技术试剂盒的制备工艺流程图；图2是抗原包被ELISA板的保存期测定结果；图3是酶标抗原的保存期测定结果。具体实施方式一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括包被了猪瘟抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。包被了猪瘟抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是通过杆状病毒表达系统获得的CSFVE2蛋白，所用包被液是碳酸盐缓冲液，所用封闭液是含2％明胶的PBST。有前期研究结果表明，在CSFV的结构蛋白中，E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白，具有更好的活性和免疫原性，能诱导机体产生CSFV的中和抗体，保护机体免受强毒的攻击，因此E2糖蛋白，既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象，也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原。本专利技术将CSFV-E2蛋白克隆入杆状病毒表达载体系统中，转染昆虫细胞，获得体外表达的外源蛋白，并将该蛋白作为诊断抗原建立ELISA抗体检测方法，与原核表达的蛋白作为包被抗原相比，杆状病毒表达系统所表达的外源蛋白更加接近真实的天然蛋白的空间构象和功能，利用该系统表达的蛋白与猪血清中抗体的结合更加具有特异性和敏感性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被了猪瘟抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被了猪瘟抗原的酶标板、阴性对照血清、阳性对照血清、20X浓缩洗液、酶标抗原、底物缓冲液A、底物液B、终止液。2.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被了猪瘟抗原的酶标板的制备过程中，所用的包被原是通过杆状病毒表达系统获得的CSFVE2蛋白，所用包被液是碳酸盐缓冲液，所用封闭液是含2％明胶的PBST。3.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗原是利用辣根过氧化物酶(HRP)通过过碘酸钠法对CSFV-E2蛋白进行标记。4.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述20X浓缩洗涤液配方为：氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠3g、氯化钾5g、吐温-202mL、蒸馏水20mL。5.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述底物缓冲液A配方：过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8gNa2HPO4·12H2O，吐温-20100μL，蒸馏水1000mL，pH5。6.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述底物液B配方：四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g柠檬酸，蒸馏水1000mL，pH2.4。7.如权利要求1所述的一种猪瘟新型抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨金易，宋长绪，曾道平，李段，王磊，
申请(专利权)人：广州万联生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44