氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒及使用方法，属于化学发光酶联免疫检测技术领域。该检测试剂盒采用直接竞争法，试剂盒包括包被有氯霉素抗原的化学发光酶标板，氯霉素标准品，氯霉素酶标抗体，化学发光液和洗涤液。该试剂盒的使用方法包括如下步骤：（1）待测样品的前处理；（2）顺序加入氯霉素标准品溶液或样品、加入氯霉素酶标抗体，最后加入化学发光液通过化学发光免疫分析仪进行氯霉素的定量检测；（3）结果处理与分析。本发明专利技术提供的检测试剂盒灵敏度高、稳定性好，适合大量样品的筛查，具有重要的实际应用推广意义。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，属于化学发光酶联免疫检测
。该检测试剂盒采用直接竞争法，试剂盒包括包被有氯霉素抗原的化学发光酶标板，氯霉素标准品，氯霉素酶标抗体，化学发光液和洗涤液。该试剂盒的使用方法包括如下步骤：（1）待测样品的前处理；（2）顺序加入氯霉素标准品溶液或样品、加入氯霉素酶标抗体，最后加入化学发光液通过化学发光免疫分析仪进行氯霉素的定量检测；（3）结果处理与分析。本专利技术提供的检测试剂盒灵敏度高、稳定性好，适合大量样品的筛查，具有重要的实际应用推广意义。【专利说明】
本专利技术涉及化学发光酶联免疫检测
，特别涉及一种。
技术介绍
氯霉素(Chloramphenicol，简称CAP)是一种有效的广谱抗生素，1947年由Ehrlich J等人从链丝菌的培养液中提取而得到的抗生素，其化学名称为D-苏式-对硝基苯基-1- 二氯乙酰基-1-3丙二醇，是白色的针状或片状晶体，味极苦。微溶于水，易溶于甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂。在酸性和中性溶液中稳定，遇碱易失效。常用于畜禽养殖中各种传染性疾病的治疗。 目前氯霉素被广泛用于家禽、家畜、蜜蜂及水产品中各种传染性疾病的治疗，但氯霉素易在动物体内蓄积，且毒性较大，在畜禽体内蓄积会严重损害其生殖系统。同时，氯霉素可危害人体造血系统，易引发人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症；可引起中毒性精神病、视神经炎、角膜瘫痕、皮疹等，对新生儿、早产儿、老年人以及肝肾功能不全的病人影响更大，对人类健康构成巨大的潜在威胁。 由于氯霉素存在严重的毒副作用，许多国家和地区均规定氯霉素最高残留限量为“不得检出”。欧盟各成员国自1994年以来已全面废止氯霉素的使用，并将氯霉素列为“不设定最高残留限量”的禁用药物，即氯霉素的最高残留限量为“不得检出”(2377/90/EC)。美国仅允许将氯霉素用于非食用动物。FDA规定氯霉素的检出限为0.3 ng/mL。2000年我国农业部将氯霉素从《中国兽药典》中删除。2002年12月农业部发布235号公告《动物性食品兽药最高残留限量》，规定所有动物性食品及所有可食性组织中不得检出氯霉素及其盐，并在出口的日常检测中，将其列为必检项目。 目前氯霉素残留已成为扩大动物性食品国际贸易的主要障碍之一，引起了世界上许多国家和国际组织的高度重视，近年来，我国出口水产品、蜂蜜等动物性食品仍多次被进口国检出氯霉素残留超标。因此需建立一种高度灵敏、低检测限的检测方法。 氯霉素残留检测方法通常采用微生物法、色谱法和免疫分析法等。微生物法虽然操作简便，检测成本低，在基层大规模筛选工作中有较大的应用价值，但其灵敏度低，检测周期长，易受组织中其它抗生素的影响。采用色谱法进行检测，成本高，耗时长，要达到较高的灵敏度，通常需要加大样品称取量，而氯霉素样品前处理多采用有机试剂萃取，蒸干后复溶的方式，加大样品量意味着萃取剂用量相应提高，从而使前处理操作更为繁琐，消耗时间延长。尽管能达到大部分检测要求，但色谱法无法应对大量样品现场快速检测的需求，因而通常作为确证方法。 ELISA方法虽具有简单、快速、灵敏的特点，也适宜大规模的筛查工作，但其灵敏度有一定的制约。因此，建立一种经济、可靠、特异、敏感、快速有效的检测方法有很大的实际意义和应用前景。化学发光免疫分析(CLIA)是化学发光和免疫分析结合的产物，将发光物质直接标记到抗原或抗体上，与抗体或抗原发生特异性免疫反应后，通过测定标记物的化学发光强度确定被测抗体或抗原的含量。具有高通量检测、灵敏度高、检测范围宽、分析速度快、价廉经济等优点，是免疫分析的重要发展方向，并被逐渐引入食品安全领域有毒有害物质的检测。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒。 本专利技术的另一目的在于提供上述氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括包被有氯霉素抗原的化学发光酶标板，氯霉素标准品，氯霉素酶标抗体，化学发光液和洗涤液；所述的氯霉素抗原为氯霉素与卵清蛋白(OVA)的偶联物，氯霉素抗原的包被浓度为0.25 mg/L ;所述的包被液为0.02 MpH8.0的Tris-HCl缓冲溶液。 优选地，所述的化学发光酶标板优选为96孔可拆不透明白色发光板。 所述的氯霉素酶标抗体为实验室前期制备；所述的酶标抗体优选为辣根过氧化酶标记的氯霉素抗体。其原浓度为lmg/mL，使用时优选为0.01 mo I/L PBST稀释6000倍。 优选地，封闭液优选为取0.1g BSA (牛血清白蛋白)、5g甘氨酸溶于10mL PBS(0.01mol/L ρΗ7.4)溶液得到。 优选地，所述的氯霉素标准品浓度为lmg/mL，使用时用0.01mol/L PBST (配方为NaH2PO4.12H20 2.9g、NaCl 8.5g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Tween-20 0.5mL，定容至 1L)将标准品稀释成浓度为0.0,0.01,0.03,0.1,0.3、1、3μ g/L的一系列氯霉素标准品溶液。 优选地，所述化学发光液由A液和B液组成，A液优选为将20mg对碘苯酚、8mg鲁米诺、1.21g Tris溶于10mL去离子水,用盐酸调pH至8.4得到；B液优选为将体积分数 0.40%H202、1.21gTris溶于10mL去离子水，用盐酸调pH至7.0得到；临用时将A液和B液按体积比1:1的比例混合。 优选地，所述的洗涤液优选为20倍浓缩洗涤液，20倍浓缩洗涤液是含有体积分数 0.5% Tween20的pH7.4 0.4mol/L的磷酸盐缓冲液，使用时用去离子水稀释成I倍洗涤液。 所述的氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒最大检测范围为0.058?0.466ng/mL,灵敏度 0.16 ng/mL,检出限 0.025 ng/mL。 上述氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤:(I)将试剂盒置于15?35°C平衡30 min以上。 (2)取出化学发光酶标板，往标准孔中加入不同浓度的氯霉素标准品溶液，样品孔中加入待测样品，然后每孔加入氯霉素酶标抗体，盖上盖板膜振摇混匀，孵育。 (3)吸除板孔中的反应液，加入洗涤液洗涤，将酶标板拍干。 (4)每孔加入化学发光反应液，轻拍混匀，盖上盖板膜，I?2min后用化学发光免疫分析仪测定各孔的发光值RLU。 (5)检测结果计算与分析:抑制率(％) =B/B0X 100 (%)，式中:B—不同浓度氯霉素标准溶液孔(或样品孔)的发光值Atl-O浓度氯霉素标准溶液发光值；以抑制率为纵坐标，氯霉素浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，从而确定样品中氯霉素的含量。 优选地，步骤(2)中所述的待测样品为鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等组织样品。 优选地，以上组织在进行检测之前，需经过以下预处理:用均质器均质组织样本，称3±0.05g样本于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，振荡lOmin，室温4000r/min以上,离心1min ;取出4mL上层液体在氮气流50_6(TC水浴中干燥；加入ImL正己烷溶解干燥的残本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氯霉素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括包被有氯霉素抗原的化学发光酶标板、氯霉素标准品、氯霉素酶标抗体、化学发光液和洗涤液；所述的氯霉素抗原为氯霉素与OVA的偶联物，所述的氯霉素抗原的包被浓度为0.25 mg/L；所述的包被液为0.02 M pH8.0的Tris‑HCl缓冲溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾道平，路俊山，卢秋鸿，陈莲英，
申请(专利权)人：广州万联生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44