本发明专利技术提供了一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有包被原的酶标板，酶标记物，氯霉素特异性抗体工作液(当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有)，氯霉素标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。本发明专利技术还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测氯霉素的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的酶联免疫试剂盒可用于检测动物组织(肌肉、肝脏等)、熟食、水产、蜂王浆、尿液、饲料和牛奶等样品中氯霉素的残留量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，其特别适于动物组织(肌肉、肝脏等)、熟食、水产、蜂王浆、尿液、饲料和牛奶等样本中氯霉素残留的检测。
技术介绍
氯霉素(Chloramphenicol, CAP)是20世纪中叶发现的一种广谱抗生素,对革兰氏阴性菌和阳性菌均有很好的抑制作用，由于其优良的抗菌性、稳定的药性和低廉的价格，曾在一段时期内作为细菌性疾病的治疗药物应用于人和动物临床，并作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产。然而，在使用中人们发现氯霉素具有毒性，在动物性食品中的残留会通过肉、蛋、奶等动物性食品对人的健康产生毒害作用。因此，我国农业部公告第235号文件规 定，氯霉素及其盐、酯(包括琥珀氯霉素)在所有食品动物的所有可食组织中不得检出。但由于氯霉素的抑菌效果好，价格低，仍有人将其用于家禽、畜类、水产品中。为了保障人民的身体健康以及扩大食品的贸易往来，建立灵敏度高、特异性强、快速、经济的氯霉素残留检测方法是很有必要的。目前，用来检测氯霉素的最常用方法主要是气相色谱、液相色谱及色谱-质谱法，这些方法虽然具有灵敏度高、结果准确、重复性好、假阳性少等优点，但仍存在一定缺点，如样品前处理过程复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，已逐渐不能满足发达国家及食品加工企业对检测方法检测限的要求。与之相比，免疫学测定方法灵敏度较高、特异性强、试样预处理简单、分析时间短，适合现场监控和大量样本的筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述不足提供一种用于氯霉素检测的酶联免疫试剂盒，其操作简单，适合现场大批量样品的筛选。本专利技术试剂盒，它含有(I)包被有包被原的酶标板；(2)酶标记物；(3)氯霉素标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液；(7)浓缩复溶液。本专利技术所提供的检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，包括预包被包被原的酶标板和酶标记物工作液；所述包被原为氯霉素抗原、抗体或抗抗体，所述酶标记物为酶标记氯霉素半抗原、酶标记氯霉素抗体或酶标记抗抗体，当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时还含有氯霉素特异性抗体工作液。所述氯霉素半抗原是将氯霉素分子结构中的硝基通过催化加氢反应得到的。所述氯霉素特异性抗体为氯霉素单克隆抗体；所述氯霉素单克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，优选为氯霉素鼠单克隆抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。以上抗体均可以用氯霉素半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白和纤维蛋白原等常用载体蛋白；所述氯霉素半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将氯霉素半抗原和载体蛋白用戊二醛法进行偶联得到。所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的羊抗鼠抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的；酶标记氯霉素半抗原是采用重氮化法或戊二醛法将标记酶与氯霉素半抗原偶联得到的；酶标记特异性抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与特异性抗体偶联得到的，辣根过氧化物酶可采用现有技术中的多种方法将其与抗抗体进行偶联，如戊二醛法、过碘酸钠法等，本专利技术经过长期的劳动创造将过碘酸钠法进行了改良，使其省时、降低辣根过氧化物酶(HRP)与抗抗体的浓度比率，节省了原材料。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括氯霉素标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。所述氯霉素标准品溶液6瓶，浓度分别为O μ g/L、0. 025 μ g/L、0. 075 μ g/L、0. 3 μ g/L、1. 2 μ g/L、4. 8 μ g/L。当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由显色液A液和显色液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为I 2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为I 2mol/L氢氧化钠溶液。所述浓缩洗涤液优选为pH值为7.1 7. 5，含有O. 8% 1. 2%吐温-20、O. OI %。 O. 03%。硫柳汞防腐剂、O. 01 O. 03mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。所述浓缩复溶液优选为pH值为7. 2 7. 7，含有8% 12%卵清蛋白、O.1 O. 4mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。其中在酶标板制备过程中所用的包被缓冲液为pH值为9. 6，O. 05mol/L的碳酸盐缓冲液，所用封闭液为PH值为9.1 9. 5，含有3% 10%小牛血清、O. 2%吐温_20、0.1 O. 3mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。本专利技术中酶标板的制备过程为用包被缓冲液将包被原稀释成O.1 O. 2 μ g/ml,每孔加入100 μ 1，37°C温育2h或4°C过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150 200 μ I封闭液，37°C温育I 2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。本专利技术中免疫原的合成过程为1.氯霉素半抗原合成(合成路线如图2)氯霉素半抗原是将氯霉素(结构式如图1)分子结构中的硝基通过催化加氢反应得到的，具体反应步骤如下将氯霉素溶于甲醇中，加入5 %的钯炭催化剂(Pd/C)，通入氢气，保持一定压力，室温反应2h，过滤除去Pd/C，蒸干溶剂得到淡黄色黏稠液体，即为氯霉素半抗原；其中所述Pd/C与氯霉素的摩尔比为1: 10。2.免疫原的合成将氯霉素半抗原与载体蛋白采用戊二醛法进行偶联得到免疫原，具体制备方法如下取氯霉素半抗原30mg，用1. 5ml水溶解，得到(I)液；取50%的戊二醛(GA) 10 μ I加入⑴中，室温下搅拌反应18h，得到(II)液；取牛血清白蛋白(BSA) IOOmg用1. 5ml水稀释后加入(II)液中，反应过夜后加入24mg NaBH4反应3h ;用三蒸水透析48h即得免疫原。本专利技术中氯霉素单克隆抗体的制备过程为(I)动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以氯霉素半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原，得到较好的多抗血清后，取出脾脏进行细胞融合。 (2)细胞融合与克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选细胞株，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术中羊抗鼠抗抗体的制备过程为以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。本专利技术的检测原理为当在微孔条上预包被氯霉素偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记氯霉素特异性抗体溶液，样本中的氯霉素与酶标板上包被的氯霉素偶联抗原竞争氯霉素特异性抗体，用显色液显色，样本吸光度值与氯霉素的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氯霉素的残留量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的氯霉素标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中氯霉素残留量的浓度范围。当在微孔条上预包被氯霉素偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入氯霉素特异性抗体溶液，样本中的氯霉素与酶标板上包被的氯霉素偶联抗原竞争氯霉素特异性抗体，加入酶标记抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，其特征在于它含有：(1)包被有包被原的酶标板；(2)酶标记物；(3)氯霉素标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液；(7)浓缩复溶液，所述包被原为氯霉素抗原、抗体或抗抗体，所述酶标记物为酶标记氯霉素抗原、酶标记氯霉素抗体或酶标记抗抗体，当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时还含有氯霉素特异性抗体工作液。
【技术特征摘要】
1.一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，其特征在于它含有(1)包被有包被原的酶标板；(2)酶标记物；(3)氣霉素标准品溶液；(4)底物显色液；(5)终止液；(6)浓缩洗涤液；(7)浓缩复溶液，所述包被原为氯霉素抗原、抗体或抗抗体，所述酶标记物为酶标记氯霉素抗原、酶标记氯霉素抗体或酶标记抗抗体，当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时还含有氯霉素特异性抗体工作液。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述氯霉素抗原是由氯霉素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述氯霉素抗体是由所述偶联抗原制备获得，其中所述氯霉素半抗原是将氯霉素分子结构中的硝基通过催化加氢反应得到的。3 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述氯霉素抗体为单克隆抗体。5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所用包被缓冲液为pH值为9.6，O.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所用封闭液为pH值为9.1 9. 5，含有3% 10%小牛血清、O.2%吐温-20、0.1 O. 3mol/L的碳酸盐缓冲液，所述百...
【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，吴鹏，段盈盈，浦小容，李勇，崔廷婷，陈炜玲，齐向武，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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