检测呋喃它酮代谢物的酶联免疫试剂盒及其方法技术

本发明专利技术提供一种检测呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒及其方法，酶联免疫试剂盒包括：包被有包被原的酶标板、呋喃它酮代谢物特异性抗体、酶标记物、呋喃它酮代谢物标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，2-硝基苯甲醛。本发明专利技术还提供了一种呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒检测方法，主要包括：先进行样本前处理，再用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术的检测试剂盒能够快速检测动物组织、水产品、蜂蜜中呋喃它酮代谢物药物，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高、费用低廉等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种检测动物组织(肌肉、肝脏)、水产品、蜂蜜中呋喃它酮代谢物的酶联免疫试剂盒及检测方法。
技术介绍
硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因为如此才导致此类药物禁止在治疗和 饲料中使用。由于硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，无法检测，但其代谢产物因和蛋白质结合而相当稳定，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。呋喃它酮作为硝基呋喃类药物的一种，代谢产物为AMOZ。目前用来检测硝基呋喃类代谢物的最常用方法是LC-UV、LC-MS和LC-MS/MS，与之相比，酶联免疫方法具有高精确度和灵敏度、较低的操作技术要求、短暂的检测时间、较大的检测样本量等特点，能够更好地满足我国畜禽养殖户、屠宰场、食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种呋喃它酮代谢物的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适用于进行大批量样品筛查的定性、定量检测方法。本专利技术提供的呋喃它酮代谢物酶联免疫检测试剂盒，包括有包被有包被原的酶标板、呋喃它酮代谢物特异性抗体、酶标记物、标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2-硝基苯甲醛，所述包被原为呋喃它酮代谢物抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。本专利技术所提供的呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒，所述呋喃它酮代谢物抗原为呋喃它酮代谢物半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。所述呋喃它酮代谢物特异性抗体为呋喃它酮代谢物单克隆抗体，是用呋喃它酮代谢物免疫原免疫动物得到的。所述呋喃它酮代谢物单克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述呋喃它酮代谢物单克隆抗体优选为呋喃它酮代谢物鼠单克隆抗体。所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶，酶标记抗抗体是采用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶与羊抗鼠抗抗体偶联得到。为了更方便的进行大量样本筛查和现场监控，所述试剂盒还包括标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2-硝基苯甲醛。所述标准品溶液为系列呋喃它酮代谢物标准品溶液，浓度分别为Oyg/L、O. 05μ g/L,0. 15yg/L、0.45yg/L、1.35yg/L、4.05yg/L，lmL/瓶。所述的终止液为 I 2mol/L的硫酸溶液，所述底物显色液A液为过氧化脲溶液，底物显色液B液为四甲基联苯胺溶液，所述的浓缩洗涤液为含1% 2%吐温-20和O. 01% O. 05%的叠氮化钠防腐剂的O. 2 O. 4mol/LpH7. 6磷酸盐缓冲液，所述的浓缩复溶液为pH值为7. 3 7. 9，含有7% 9%酪蛋白、O. lmol/L的磷酸盐缓冲液。其中所述酶标板在制备过程中所用到的包被缓冲液为pH9. 4 9. 6的O. 05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭缓冲液为PH7. 4的O. 05% O. 5%的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液。本专利技术酶标板的制备主要为用包被缓冲液将包被原稀释成O. 2 O. 3 μ g/ml，每孔加入150 μ 1，37°C避光孵育2h或4°C过夜，倾去孔中液体，洗涤液洗涤I 2次，拍干，每孔中加入150 μ I封闭液，37°C避光孵育2h，倾去孔中液体拍干，用铝膜真空密闭保存。本专利技术中包被原和免疫原的合成过程为1.半抗原合成(合成路线如图1) 2. OI g呋喃它酮代谢物(AMOZ)和20ml DMF的混合液，室温下缓慢滴加入2.68-5. 36g对苯二甲醛的50-100ml DMF溶液中，滴加完毕后室温至60°C反应2_4小时，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色AMOZ衍生物。2.免疫原的合成(I)取呋喃它酮代谢物半抗原14mg用ImlDMF溶解，得到溶液I。(2)取BSA40mg用6ml水溶解，得到溶液2。(3)将溶液I滴加入溶液2中，得到溶液3，室温反应24h。(4)取 NaBH4Hmg 用 O. 2ml0.1MNaOH 溶解后中入溶液 3 中，4°C反应 2h。(5)用O. Olmol/IPBS 4°C透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。(6)分装，于-20°C保存备用。3.包被原的合成(I)取呋喃它酮代谢物半抗原12mg用ImlDMF溶解，得到溶液I。(2)取OVA 36mg用7ml水溶解，得到溶液2。(3)将溶液I滴加入溶液2中，得到溶液3，室温反应24h。(4)取 NaBH416mg 用 O. 2ml0.1MNaOH 溶解后中入溶液 3 中，4°C反应 2h。(5)用O. Olmol/IPBS 4°C透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。(6)分装，于_20°C保存备用。4.单克隆抗体的制备动物免疫呋喃它酮代谢物半抗原与载体蛋白偶联物免疫8-10周龄Bal b/c小鼠。细胞融合与克隆化取免疫后的鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO9个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。本专利技术还提供了一种用呋喃它酮代谢物酶联免疫试剂盒检测样品中呋喃它酮代谢物残留的方法，采用本方法对动物组织、水产品、蜂蜜样品中的呋喃它酮代谢物进行定性或定量检测，样本前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品，试剂盒具有很高的精确度和灵敏度，较低的操作技术要求和短暂的检测时间，检测样本量大等特点，主要步骤包括I)将待测样品进行前处理，得到待测样品溶液；2)用酶联免疫试剂盒检测待测样品溶液；3)分析检测结果。附图说明图1 :呋喃它酮代谢物半抗原合成2 :呋喃它酮代谢物标准曲线具体实施例方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例一抗原、抗体及酶标记抗抗体的制备1.呋喃它酮代谢物半抗原的制备2. OI g呋喃它酮代谢物(AMOZ)和20ml DMF的混合液，室温下缓慢滴加入2.68-5. 36g对苯二甲醛的50-100ml DMF溶液中，滴加完毕后室温至60°C反应2_4小时，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色AMOZ衍生物。2.免疫原的合成(I)取呋喃它酮代谢物半抗原14mg用ImlDMF溶解，得到溶液I。(2)取BSA40mg用6ml水溶解，得到溶液2。(3)将溶液I滴加入溶液2中，得到溶液3，室温反应24h。(4)取 NaBH4Hmg 用 O. 2ml0.1MNaOH 溶解后中入溶液 3 中，4°C反应 2h。(5)用O. Olmol/IPBS 4°C透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。(6)分装，于_20°C保存备用。3.包被原的合成(I)取呋喃它酮代谢物半抗原12mg用ImlDMF溶解，得到溶液I。(2)取OVA 36mg用7ml水溶解，得到溶液2。(3)将溶液I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种呋喃它酮代谢物酶联免疫检测试剂盒，包括有：包被有包被原的酶标板、呋喃它酮代谢物特异性抗体、酶标记物、标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2?硝基苯甲醛，所述包被原为呋喃它酮代谢物抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。

【技术特征摘要】
1.一种呋喃它酮代谢物酶联免疫检测试剂盒，包括有包被有包被原的酶标板、呋喃它酮代谢物特异性抗体、酶标记物、标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2-硝基苯甲醛，所述包被原为呋喃它酮代谢物抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述呋喃它酮代谢物抗原为呋喃它酮代谢物半抗原与载体蛋白的偶联物，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。3.如权利要求1-2所述的试剂盒，其特征在于所述呋喃它酮代谢物半抗原的制备方法主要包括如下步骤2.Olg呋喃它酮代谢物(AMOZ)和20ml DMF的混合液，室温下缓慢滴加入2. 68-5. 36g对苯二甲醛的50-100ml DMF溶液中，滴加完毕后室温至60°C反应2-4小时，除去溶剂，柱层析纯化，得到淡黄色AMOZ衍生物。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的呋喃它酮代谢物特异性抗体为呋喃它酮代谢物单克隆抗体。5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。6.如权利要求1所述的试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：何方洋，孙震，冯静，冯才茂，刘琳，朱亮亮，刘玉梅，石洁，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：