一种检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术为检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。所述试剂盒包括：包被氟乐灵抗原的酶标板、氟乐灵标准品、氟乐灵抗体工作液、氟乐灵酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标二抗工作液和抗体工作液加入对应的酶标板微孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下显色剂呈现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中氟乐灵的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测农作物中氟乐灵的残留量。

Enzyme linked immune reagent kit for detecting spirit and its detection method

The invention relates to an ELISA kit and a detection method thereof, which is sensitive, accurate, rapid, simple in operation and strong in specificity, and is suitable for the detection of a large number of samples. The kit includes: encapsulated trifluralin antigen ELISA plate, trifluralin standard, trifluralin antibody solution, trifluralin enzyme labeled two antibody fluid, A, substrate substrate liquid liquid B, termination liquid, concentration dilution liquid and condensed washing liquid. The principle of detection of trifluralin enzyme immunoassay kit is immunoassay solid-phase indirect competitive enzyme, the enzyme extracted from the samples, the standard two resistance of working fluid and the corresponding antibody was added to microtiter plate microporous, incubated for a period of time, wash the plate and adding substrate solution A, substrate solution B significantly the color agent under the action of the enzyme showed blue, adding the stop solution, the color changed from blue to yellow. The depth of the color is inversely proportional to the content of the standard sample or sample. The method can be directly used for the determination of the residues of fluoride in crops.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽药残留检测
，特别是检测大米中氟乐灵的酶联免疫试剂盒。
技术介绍
氟乐灵是优良的旱田除草剂。主要用于棉花、大豆、花生、向日葵、甘蓝、辣椒、豆类、果园等，也可用于麦地和旱稻田，防除一年生禾本科和种子繁殖的多所生杂草和某些阔叶杂草，如稗草、狗尾草、马唐、看麦娘、蟋蟀草、千金子、早熟禾、雀麦、野燕麦、雀舌草、藜、苋、粟米草、繁缕、地肤、马齿苋等。对龙葵、苍耳、苘麻等宿根性多年生杂草防效差或基本无效。对成株杂草无效。高梁、谷子等敏感作物不能使用；甜菜、番茄、马铃薯、黄瓜等抗性不强，又能用作移栽田。合世界年消费量达万吨及水平。广谱的旱地芽前除草剂。可用于棉花、大豆、豌豆、油菜、花生、土豆、冬小麦、大麦、蓖麻、向日葵、甘蔗、蔬菜、果树等，主要用于防除单子叶杂草和一年生阔叶杂草，如稗草、大画眉、马唐、狗尾草、蟋蟀草、早熟禾、千金子、牛筋草、看麦娘、野燕麦等，也可防除小粒种子的藜、苋菜、马齿苋、繁缕、蓼等双子叶杂草。酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本专利技术旨在建立一种检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法。
技术实现思路
为了克服色谱法的不足，本专利技术提供一种检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。本专利技术检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、氟乐灵标准品、氟乐灵抗体工作液、氟乐灵酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。本专利技术检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、氟乐灵标准品的制备、氟乐灵抗体工作液的制备、氟乐灵酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。其进一步特征在于：所述的酶标板经由氟乐灵抗原包被制备，具体步骤是将氟乐灵半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将氟乐灵包被抗原稀释成1：40000比例，100μL/孔，37℃避光孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150μL/孔，37℃放置1.5h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。氟乐灵标准品浓度分别为0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg、8.1mg/kg。所述氟乐灵抗体工作液是采用氟乐灵人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：60000比例制备。所述氟乐灵酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：2000比例，所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5%吐温-20，0.1mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法包括以下步骤：(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液中；(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；(3)取包被有氟乐灵抗原的酶标板，加标准品/样本50μL/孔到对应的微孔中，加入氟乐灵酶标二抗工作液，50μL/孔，然后加入氟乐灵抗体工作液，50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min；(4)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；(5)加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应15～20min；(6)加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据）；(7)以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中氟乐灵的含量。本专利技术检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法的测定原理：样品中的氟乐灵与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中氟乐灵的含量。如果样品中的氟乐灵含量少，显色深；反之，则显色浅。本专利技术的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的快速检测。具体实施方式氟乐灵蛋白质偶联物的制备：采用琥珀酸酐法得到带羧基的氟乐灵半抗原衍生物，之后取0.05mmol与载体蛋白BSA按10：1的结合比混合在0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中，然后加入0.15mmol碳二亚胺，搅拌置室温反应24h，最后于0.2mol/LpH7.6的PBS缓冲液中透析两天，除去未反应的半抗原，将得到的蛋白质偶联物溶液于-20℃保存备用。氟乐灵抗体的制备：选用健康成年纯种BALA/C小鼠，取与蛋白质偶联制备的免疫抗原50μg与等量完全弗氏佐剂混合采用腹腔注射进行初次免疫，之后每隔3周用相同剂量免疫抗原加等量不完全弗氏佐剂采用腹腔注射进行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾静脉采血测定抗血清效价至一定滴度后，用相同剂量不加佐剂进行末次免疫，3天后取脾制备脾细胞悬浮液与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出所需要的杂交瘤细胞系进行克隆化，选择处于对数生长期的杂交瘤细胞进行冻存，用于腹水制备，先腹腔注射0.5ml液体石蜡于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7-10天后可产生腹水，待腹水尽可能多时用注射器抽取腹水，反复收集数次，4000rpm离心15min，收集上清，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水对单克隆抗体进行纯化，冷冻干燥得冻干粉后于-20℃保存备用。制备包被有氟乐灵包被抗原的酶标板：包被抗原是将氟乐灵半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的，用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将氟乐灵抗原稀释成1:40000比例，100µL/孔，37℃放置2h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300µL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150µL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。氟乐灵标准品配制浓度分别为0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg、8.1mg/kg。氟乐灵抗体工作液的制备：采本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括酶标板、氟乐灵标准品、氟乐灵抗体工作液、氟乐灵酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

【技术特征摘要】
1.检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括酶标板、氟乐灵标准品、氟乐灵抗体工作液、氟乐灵酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。2.检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、氟乐灵标准品的制备、氟乐灵抗体工作液的制备、氟乐灵酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。3.根据权利要求2所述的检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的酶标板制备方法为将氟乐灵半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到氟乐灵包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将包被抗原稀释成1：40000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入稀释后的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150μL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。4.根据权利要求2所述的检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：氟乐灵标准品的浓度分别为0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg、2.7mg/kg、8.1mg/kg。5.根据权利要求2所述的检测氟乐灵的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述的氟乐灵抗体工作液是采用氟乐灵人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪霞，杜霞，刘静，
申请(专利权)人：镇江先创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32