本发明专利技术提供了一种大观霉素药物的酶联免疫检测试剂盒，包括酶标板、酶标记的抗抗体、大观霉素标准品、底物显色液、终止液、洗涤液、大观霉素抗体，所述酶标板上包被有大观霉素半抗原‑卵清蛋白偶联物。本发明专利技术还公开了一种用上述酶联免疫检测试剂盒检测牛奶中大观霉素的方法，首先处理待测牛奶样品，然后用酶联免疫检测试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的酶联免疫检测试剂盒，结构简单、使用方便、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品定性、定量的检测。
ELISA kit for spectinomycin and its use
The present invention provides a kind of spectinomycin ELISA kit, including ELISA plate, enzyme labeled antibody, spectinomycin standard, chromogenic substrate solution and stop solution, washing liquid, spectinomycin antibody, the ELISA plate coated with spectinomycin half ovalbumin antigen conjugates. The invention also discloses a method for a grand with the ELISA kit for detection of vancomycin in milk, milk processing sample first, and then were detected by ELISA kit, and analyzing the test result. The ELISA kit provided by the invention has the advantages of simple structure, convenient use, portability, high efficiency, accuracy, simplicity and suitability for the qualitative and quantitative detection of a large number of samples.
【技术实现步骤摘要】
大观霉素药物的酶联免疫检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种大观霉素药物的酶联免疫检测试剂盒，其特别适于牛奶中大观霉素药物残留的检测。技术背景大观霉素为链霉菌所产生的一种氨基环醇类抗生素，是一新型特效专治淋病的抗生素。大观霉素能阻止细菌细胞壁蛋白质的合成并能阻碍已合成蛋白质的释放，被广泛应用于兽医学领域。由于大观霉素具有强大的抑菌杀菌作用和能促进动物生长等作用，一些厂家在饲料中非法添加，同时养殖用户又不遵守休药期，导致牛奶中大观霉素的残留超标的现象越来越多，对人民的健康造成了极其严重的影响。鉴于此种状况,各国政府和国际组织都开始对兽药残留实施愈来愈严格的监控措施。大观霉素传统的检测方法有微生物检定法，薄层色谱法，高效液相色谱法，气相色谱法，超高效液相色谱一串联质谱技术等，这些方法用于牛奶中的大观霉素检测，前处理繁琐序复杂，测定周期长，甚至需要昂贵的仪器，成本较高，不能满足牛奶样品中大观霉素的实时快速检测。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种大观霉素药物的酶联免疫检测试剂盒，其包括酶标板、酶标记抗抗体、大观霉素标准品、底物显色液、终止液、洗涤液、大观霉素抗体，所述酶标板上包被有大观霉素半抗原-卵清蛋白偶联物。所述大观霉素半抗原-卵清蛋白偶联物由大观霉素半抗原与卵清蛋白偶联得到。所述大观霉素半抗原由大观霉素与羧甲基羟胺反应得到。所述大观霉素抗体为大观霉素单克隆抗体或大观霉素多克隆抗体。所述大观霉素抗体由大观霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白，所述大观霉素半抗原为大观霉素-羧甲基羟胺。所述大观霉素标准品溶液的浓度分别为0μg/L，0.05μg/L，0.15μg/L，0.45μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L。所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶，所述显色底物液为显色底物A液和显色底物B液，所述显色底物A液为过氧化脲，显色底物B液为四甲基联苯胺，终止液为2mol/L盐酸。所述洗涤液为含有1.0-1.5％吐温20和0.5‰Proclin300防腐剂的Tris缓冲液，所述百分比、千分比均为体积比。本专利技术的另一个目的还提供了一种应用上述大观霉素药物的酶联免疫检测试剂盒检测牛奶样品中大观霉素残留的方法，其主要包括：首先处理待测牛奶样品；然后用上述大观霉素药物的酶联免疫检测试剂盒进行检测；最后分析检测结果。本专利技术大观霉素药物的酶联免疫检测试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测样品中大观霉素药物的残留量；对牛奶样品的前处理要求不高，样品前处理过程比较简单，能同时快速检测大批量牛奶样品。本专利技术的酶联免疫检测试剂盒，本身结构简单、使用方便、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品定性、定量的检测。本专利技术的酶联免疫检测试剂盒可以在大观霉素残留检测中发挥重要作用。附图说明图1：大观霉素半抗原合成技术路线；图2：大观霉素标准品抑制曲线。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1大观霉素药物的酶联免疫检测试剂盒大观霉素药物的酶联免疫检测试剂盒，其包括：1)96孔或48孔酶标板，其上包被大观霉素半抗原-卵清蛋白偶联物；2)酶标记抗抗体，为用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；3)大观霉素标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L，0.05μg/L，0.15μg/L，0.45μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L；4)底物显色液由底物显色A液和底物显色B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺；5)终止液为2mol/L盐酸；6)洗涤液为含有1.0％～1.5％吐温20(百分比为体积比)和0.5‰Proclin300的Tris缓冲液(千分比为体积比)；7)大观霉素抗体，为大观霉素单克隆抗体。实施例2酶联免疫检测试剂盒主要成分的制备1、免疫原和包被原合成免疫原合成包括两步，第一步将大观霉素与羧甲基羟胺反应合成大观霉素半抗原，第二步将大观霉素半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免疫原。1)大观霉素半抗原的合成，路线图见图1称取100mg大观霉素和140mg羧甲基羟胺溶于3mL吡啶中，室温搅拌24小时，吹干，加水10mL，用0.2mol/LNaOH调至pH9左右，用CH2Cl2提取3次,每次20mL，弃CH2Cl2，水层用HCl调至pH3,再用CH2Cl2提取3次，每次20mL，用无水硫酸钠脱水，过滤，将滤液在45℃下吹干，60℃烘干3小时，得白色晶体，即为大观霉素半抗原。2)免疫原合成称取50mg大观霉素半抗原，加2mL二氧六环，30μL三正丁胺，30μL氯甲酸异丁酯，在10℃搅拌1h，将反应液倒入牛血清白蛋白(160mg牛血清白蛋白溶于5mLH2O和5mL二氧六环)，用NaOH调至pH8.5，再在10℃下搅拌6h。以流动的蒸馏水在4℃下透析24h，透析液经冷冻干燥，得到免疫原。3)包被原合成用大观霉素半抗原与卵清蛋白偶联得到，方法同免疫原合成。2、单克隆抗体的制备1)动物免疫挑选8周龄的Balb/c小鼠，用含有氟氏完全佐剂的免疫原及大观霉素半抗原-牛血清白蛋白偶联物进行皮下注射，免疫剂量为150μg/只，每2周加强免疫一次，第4次加强免疫后一周，得到效价为1:1000的抗体血清。2)骨髓瘤细胞和脾细胞的制备SP2/0骨髓瘤细胞采用常规的RPMI-1640培养液培养，使细胞处于对数生长期，制成SP2/0骨髓瘤细胞细胞悬液；取经免疫的小鼠脾脏，破碎，过400目的不锈钢纱布过滤制成脾细胞悬液，计数后备用。3)细胞融合和单克隆化将1×108SP2/0骨髓瘤细胞和5×108脾细胞在PEG作用下进行融合，对于分泌抗体培养孔，采用间接竞争ELISA测定以筛选阳性孔。采用有限稀释法对阳性孔进行单克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该抗体特异性是针对大观霉素的，灵敏度能达到0.05μg/L。4)细胞冻存和复苏将大观霉素的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成(1-2)×106个/mL的细胞悬液，每个冻存管1mL，采用逐渐降温法保存在液氮中。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，然后移至冰上5min，再转入锥形瓶中，加入10mL温热的完全培养液中，移入CO2培养箱中培养。5)单克隆抗体的大量生产与纯化取健康的Balb/c雌鼠，腹腔注入降植烷0.5mL/只，7天后腹腔注射大观霉素的单克隆杂交瘤细胞株3×105个/只，隔天观察，10-20天后采集腹水。先用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水初步纯化，后采用装有Protein-A柱子的AKTApurifier100纯化仪进行纯化，纯化后抗体-20℃保存。3、羊抗鼠抗抗体制备：是以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、酶标记羊抗鼠抗抗体的制备将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物物酶(HRP)采用马来酰亚胺基类活泼酯法进行偶联。1)采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)活化辣根过氧化物物酶，取100μL约10mg/mL的HRP溶液，按SMCC：ALP摩尔投料比(3～5):1加入SMCC，25℃反应30min后，用G25脱盐本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大观霉素药物的酶联免疫检测试剂盒，包括酶标板、酶标记抗抗体、大观霉素标准品、底物显色液、终止液、洗涤液、大观霉素抗体，所述酶标板上包被有大观霉素半抗原‑卵清蛋白偶联物。
【技术特征摘要】
1.一种大观霉素药物的酶联免疫检测试剂盒，包括酶标板、酶标记抗抗体、大观霉素标准品、底物显色液、终止液、洗涤液、大观霉素抗体，所述酶标板上包被有大观霉素半抗原-卵清蛋白偶联物。2.如权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述大观霉素半抗原-卵清蛋白偶联物由大观霉素半抗原与卵清蛋白偶联得到。3.如权利要求1或2所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述大观霉素半抗原由大观霉素与羧甲基羟胺反应得到。4.如权利要求3所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述大观霉素抗体为大观霉素单克隆抗体或大观霉素多克隆抗体。5.如权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述大观霉素抗体由大观霉素半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白，所述大观霉素半抗原为大观霉素-羧甲基羟胺。6.如权利要求1或2所述的酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨绍元，杨少琼，
申请(专利权)人：云南辉瑞贝尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53
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