本实用新型专利技术公开了大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔，包被层附着在所述固相载体的微孔表面，封闭层位于包被层上。本实用新型专利技术的试剂盒操作简便，特异性、精确度、灵敏度均较高，可以满足普通实验室的要求。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本技术属于涉及生物
，具体而言，涉及大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
技术介绍
在凝血过程中，内源性和外源性凝血途径通过不同的启动和反应方式激活凝血因子X转变为Xa，Xa可使凝血酶原分子中的Arg (280)-Tyr (281)及Arg (316)-Ile (317)间的肽键同时断裂，释放出凝血酶原片段F1+2，即Al a(4)-Arg(323)，同时C端释放出由轻链A和重链B组成的丝氨酸蛋白酶，即凝血酶。该凝血酶能够反馈裂解酶原本身，释放出片段I (Fl)和片段 2 (F2)，序列分别为 Ala (I) -PHe (157)，Ser (158) -Arg (180)。因此血液中 F1+2的含量可较灵敏的反应出凝血酶原活化的状态，可作为对高凝状态及抗凝和溶栓治疗进行监测的分子标志。临床上在深静脉血栓形成、肺栓塞、弥散性血管内凝血、溶栓治疗、白血病·大鼠作为生物医学实验中常用的动物模型，广泛应用于基础医学领域各项生理病理机制、药物以及物理治疗方法的研究中，但是目前没有针对大鼠F1+2检测的ELI SA试剂盒，因此有必要制备高灵敏度、特异性的产品。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测技术是利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的待测物，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。由于其特异性强、灵敏度、操作简便及不需大型仪器等优点，现广泛用于生物样本的定量检测实验中。因此，有必要选用一种快速、简便能够定量且灵敏度、准确度和特异性高的方法来进行大鼠凝血酶原片段F1+2的检测。
技术实现思路
本技术目的是提供一种大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，其操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求。为了实现本技术的目的，拟采用如下技术方案本技术一方面涉及大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述封闭层位于包被层上。在本技术的一个优选实施方式中，所述的包被层含有兔抗大鼠Fl多克隆抗体，所述的封闭层包含有牛血清白蛋白。在本技术的一个优选实施方式中，所述的多个微孔是指96个微孔。在本技术的一个优选实施方式中，所述的固相载体是聚苯乙烯试剂板。本技术的试剂盒特异性、精确度、灵敏度均较高，可以满足普通实验室的要求。附图说明图I为本技术一具体实施例酶标板结构示意图。I固相载体，2包被层,3封闭层。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本技术的限定。本试剂盒应用双抗夹心酶联免疫分析法测定大鼠血浆样本中F1+2的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的兔抗大鼠Fl多克隆抗体，4°C过·夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。由此可见，该酶标板微量孔内主要有2层2，包被层；3，封闭层。试剂盒的检测抗体，即检测液A，为生物素化的兔抗大鼠F2多克隆抗体，并以亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)作为检测液B，与检测抗体特异性结合。其余试剂盒组份包括重组蛋白F1+2制备的标准品、底物TMB和终止液。I.重组蛋白的获得重组Fl和F2将作为免疫原免疫动物获得抗体，凝血酶原将用作Fl和F2抗体的反向筛选，而重组F1+2将用作ELI SA试剂盒的标准品。I)引物设计与PCR扩增参照GenBank公布的大鼠凝血酶原(Prothrombin)基因序列(NM_022924. 2),分别设计扩增Fl (氨基酸序列1A-157R)、F2(氨基酸序列158S-323R)、F1+2 (氨基酸序列1A-323R)及凝血酶原的特异性引物，并用特异性条件扩增。A. Fl 上游引物5’ -GCGCGAATTCGCCAACAGCGGCTTCCTG-3> (EcoR I)下游引物5’-CCCAAGCTTCTAGCGAGGAGTCATTTTCACAGTGG-3’ (Hi nd III)扩增条件95°C预热5分钟；95°C变性30秒；56°C退火30秒；72°C延伸30秒；72°C终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4°C保存。B. F2 上游引物5，-CGCGAATTCTCAAGAGGTTCCAAGGAGAATC-3> (EcoRI)下游引物5’-CCCAAGCTTCTACCTCTCATCGAAGAAGGTGTG-3’ (Hi nd III)扩增条件95°C预热5分钟；95°C变性30秒；58°C退火30秒；72°C延伸30秒；72°C终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4°C保存。C. F1+2 上游引物5’ -GCGCGAATTCGCCAACAGCGGCTTCCTG-3’ (EcoR I)下游引物5’-CCCAAGCTTCTACCTCTCATCGAAGAAGGTGTG-3’ (Hind III)扩增条件95°C预热5分钟；95°C变性50秒；58°C退火50秒；72°C延伸50秒；72°C终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4°C保存。D.凝血酶原上游引物5’ -GACGAATTCCAGCATGTGTTCCTGGCCCCTC-3> (EcoR I)下游引物5，-GCCGAAGCTTCTATCTATGCTGATCAATGACTTTCTGCATCC-3>(HindIII)扩增条件95°C预热5分钟；95°C变性I分钟；57°C退火I分钟；72°C延伸I分10秒；72°C终末延伸10分钟；30个循环，冷却至4°C保存。分别取上述PCR扩增产物10μ 1，进行I. 5%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统进行观察、拍摄及分析结果，并用凝胶回收试剂盒进行PCR产物的回收。2)上述基因的克隆与鉴定A. Fl ^F1的PCR产物和原核表达载体pET28a适量，用EcoR I/Hi ndIII进行双酶切，并将酶切产物按2 I (摩尔比)比例进行连接反应，将连接后的质粒转化至BL21感受态细胞，涂于含卡那霉素(25yg/ml)的LB平板上，培养过夜并于次日挑选阳性克隆，进行PCR、限制性内切酶酶切以及DNA序列测序鉴定。B. F2 :克隆与鉴定方法参照Fl片段。C. F1+2 :克隆与鉴定方法参照Fl片段。D.凝血酶原克隆与鉴定方法参照Fl片段。3)蛋白表达及纯化将鉴定正确的阳性克隆菌活化后，1%接种，37°C，250r/mi η摇菌2_3小时，使培养液的OD6tltl达到O. 4-0. 6，加入I PTG终浓度lmmol/L，20°C诱导过夜，离心收集细菌，力口入原菌液体积的1/5-1/10体积的超声裂解液配方50mMTr i s-HCl (PH8. O)，2mMEDTA, 100mMNaCl,0. 5% TritonX-100, lmg/ml溶菌酶。进行冰浴超声，超声5秒，间歇10秒，一般总超声时间为10分钟；然后将超声后的裂解液12，000r/mi η离心15分钟，取上清液按His Tra本文档来自技高网...
【技术保护点】
大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔，包被层附着在所述固相载体的微孔表面，封闭层位于包被层上。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨娟，李华渊，童晓玲，李庆，从旭霞，姚雯，何峰容，
申请(专利权)人：武汉优尔生科技股份有限公司，
类型：实用新型
国别省市：
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