人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒制造技术

本实用新型专利技术公开了人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述封闭层位于包被层上。本实用新型专利技术的试剂盒一次可处理大量样品，节约了大量的人力、物力，提高了工作效率。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术属于涉及生物
，具体而言，涉及人胃泌素酶联免疫吸附测定(ELI SA)试剂盒。
技术介绍
胃泌素(GT)是一种重要的胃肠激素，它主要由G细胞分泌。G细胞是典型的开放型细胞，以胃窦部最多，其次是胃底、十二指肠和空肠等处。人胰岛的D细胞亦能分泌胃泌素，1978年Rehfeld证明人的脑脊液和某些脑组织中存在胃泌素，胃泌素几乎对整个胃肠道均有作用，它可促进胃肠道的分泌功能，能刺激ECL细胞分泌组胺，间接促进壁细胞分泌盐酸；促进胃窦，胃体收缩，增加胃肠道的运动，同时促进幽门括约肌舒张，故其主要作用是促进胃排空；促进胃及上部肠道粘膜细胞的分裂增殖；促进胰岛素和降钙素的释放。胃泌 素还能刺激胃泌酸腺区黏膜和十二指肠黏膜的DNA、RNA和蛋白质合成，从而促进其生长。产物以氨基酸的长度分成五种GT-71、GT-52、GT-34、GT-17、GT-14。GT-14有14个氨基酸，而14个氨基酸就有全部的生理活性。近年发现，颊粘膜、舌、食道、中枢神经系统也含有胃泌素。在临床上能观察到，切除胃窦的病人，血清胃泌素水平下降，同时可发生胃粘膜萎缩；在患有胃泌素瘤的病人，血清胃泌素水平很高，且多伴有胃粘膜的增生、肥厚。血清胃泌素是胃泌素瘤诊断和疗效监测的重要指标。血清胃泌素测定是一种特殊的诊断手段，正常人和消化性溃疡病患者空腹血清胃泌素为50 150pg/ml，本病常大于500pg/ml，甚者高达1000pg/ml。当空腹血清胃泌素大于1000pg/ml，伴有相应的临床症状者，可确诊为本病。恶性贫血患者的空腹血清胃泌素显著增高，平均值为1000pg/ml，甚至高达10000pg/ml。其他如胃窦G细胞增生、肾功能衰竭、甲状腺功能亢进、萎缩性胃炎、残留胃窦及H2受体阻断剂、酸泵抑制剂的治疗，均可使血清胃泌素增高，应注意鉴别。通过胃液分析和血清胃泌素的测定，约95%以上的患者可确立诊断。目前报道的GT定量测定方法主要是放射免疫法。放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好，常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足，RIA将逐渐被取代。酶联免疫吸附测定(ELISA)的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的靶分子，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。它是基于RIA的基础上发展起来的，ELISA在继承了 RIA的高灵敏度、精密度好的特点，同时ELISA还克服了 RIA的一些缺点，如放射污染、试剂盒稳定期不长等，现广泛用于生物样本的定量检测试验中。制备高质量的ELISA试剂盒的关键因素是抗原和其对应的高特异性、高亲和力的抗体。但是如前所述，GT是分子量小于IOkD的多肽。通常情况下，分子量在5kD以下的肽类一般无免疫原性；分子量在5-10kD之间的肽类的免疫原性较弱。因此，本专利旨在将GT偶联到大分子的载体蛋白上，赋予GT较强的免疫原性，从而刺激机体产生大量针对GT的高特异性和高亲和力的抗体，为试剂盒的制备提供高质量的原材料。因此，有必要选用一种快速、简便能够定量且灵敏度、准确度和特异性高的方法来进行胃泌素的测定。
技术实现思路
本技术目的是提供人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒，其操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求。为了实现本技术的目的，拟采用如下技术方案本技术一方面涉及人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述封闭层位于包被层上。在本技术的一个优选实施方式中，所述的包被层含有人胃泌素抗体，所述的封闭层包含有牛血清白蛋白。在本技术的一个优选实施方式中，所述的多个微孔是指96个微孔。在本技术的一个优选实施方式中，所述的固相载体是聚苯乙烯试剂板。本技术的试剂盒一次可处理大量样品，节约了大量的人力、物力，提高了工作效率。附图说明图I为本技术一具体实施例酶标板结构示意图。I固相载体，2包被层,3封闭层。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本技术的限定。本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中GT的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗体，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入待测标本及生物素化的GT，形成待测标本中的GT和生物素化的GT竞争结合酶标板上包被的抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒的制备。人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法，其具体步骤为a、GT全抗原的制备将60mg GT与50mg牛血清白蛋白溶于4mL O. lmol/L磷酸钠缓冲液(PB, pH 7. 4)中，加O. 2mL 25%的偶联剂戊二醛(GA)连接成GT-GA-BSA复合物，室温反应20h后，用O.Olmo 1/L磷酸钠缓冲液(pH 7. 0-7. 4)透析。b、抗人GT抗体的制备健康雄性新西兰大白兔I只，用GT-GA-BSA复合物免疫。将上述透析后的偶联产物进行紫外扫描、蛋白质谱、BCA(或其它方法如Bradford)进行偶联比例的分析及蛋白的定量。蛋白定量后分装冻干_80°C保存。取上述冻干偶联产物若干，用高压除菌的蒸馏水或去离子水重悬GT-GA-BSA至终浓度为200 μ g/mL。取600 μ I重悬好的GT-GA-BSA然后加入等体积的弗氏完全佐剂充分乳化混匀。兔后足垫、背部皮下多点免疫。14d后，进行加强免疫，剂量与基础免疫剂量相同。每两周免疫一次，共免疫四次，第四次免疫后14天，从颈动脉取全血，测定抗体效价。C、人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒的研制人胃 泌素酶联免疫吸附测定试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中GT的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗体，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入待测标本及生物素化的GT，形成待测标本中的GT和生物素化的GT竞争结合酶标板上包被的抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒的制备。2、经过对试剂盒一系列的质量指标检测，包括灵敏度、重复性、特异性、回收率及线性测定，表明该检测体系成熟，本试剂盒各项指标检测结果a.标准曲线 浓度 Log 、标准品OD值OD值平均值 (pg/ml) (浓度)18. 52I. 27I. 9182.038I. 97855.56I. 74I. 372本文档来自技高网...

【技术保护点】
人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述封闭层位于包被层上。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨娟，李华渊，李庆，童晓玲，从旭霞，何峰容，
申请(专利权)人：武汉优尔生科技股份有限公司，
类型：实用新型
国别省市：