一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检测试剂盒，具体公开了酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒。本发明专利技术通过基因工程表达重组蛋白MOMP，并以此为抗原包被固相载体进行酶联免疫吸附检测。本发明专利技术试剂盒使用基因工程表达的高纯度的重组抗原作为包被抗原，特异性高，灵敏性好。且在抗原包被固相载体后用抗原保护剂对包被好的抗原进行保护，延长了抗原的保存时间。此外，本发明专利技术使用的酶联抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗禽IgG，可广泛针对禽类，如鸡、鸭、鹅等进行通用性的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测试剂盒，具体地说，涉及酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒。
技术介绍
禽衣原体病(AvianChlamydiosis)是由鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci，Cp)引起的一类家禽、鸟类及哺乳动物等人畜共患传染性疾病。常常表现为禽类呼吸道和消化道疾病症状，感染家禽嗜睡、发烧、体重下降、鼻腔和眼睛异样分泌物、气囊炎、腹膜炎、心包炎、肝周炎以及产蛋禽产蛋量下降，病死率可达30％；观赏鸟类感染后表现为食欲减退、体重减轻、腹泻、黄色粪便、窦炎、呼吸道炎症以及肝脾肿大、气囊炎、心包炎、腹膜炎等症状。该病偶尔也会感染牛、羊和其它哺乳动物，引起动物生殖道炎性病变、孕畜流产等症状。人类在自然条件下可感染该病，主要引起呼吸道感染、肺炎和菌血症，所以临床上又称之为鹦鹉热(psittacosis)或鸟疫(Ornithosis)。公开号为CN103981252A的中国专利申请公开了一种特异快速检测鹦鹉热嗜衣原体的TaqManMGB探针实时荧光定量PCR的方法。根据GenBank中牛鹦鹉热衣原体主要外膜A蛋白的基因序列，利用Primer5.0软件设计引物，包括上游引物和下游引物序列，同时针对引物之间的基因片段设计TaqMAN探针，5’端标记FAM，3’端标记NFQ-MGB，扩增目标片段的长度为180bp。但该方法由于采集样本过程繁琐复杂不适于大量样本的检测，且所需设备价格昂贵，不能作为基层养禽业的衣原体常规检测手段。此外，该方法中扩增目标片段只有180bp，很容易造成假阳性结果从而降低试验准确率。目前国内外对鹦鹉热衣原体的主要检测手段包括两大类即抗原检测和血清学检测。抗原检测方法有直接染色，免疫组织化学染色，病原分离和鉴定，免疫荧光技术，聚合酶链反应，双抗夹心酶联免疫吸附试验。血清学检测方法有补体结合试验，间接血凝试验，胶体金试纸条法等。直接染色病原法方法操作简单、检测快，但是灵敏性和特异性一般，结果判定需要有丰富的专业技术经验，判定结果受主观影响较大，尤其辨认衣原体的EB和RB时候相当困难。病原分离鉴定方法病原分离需要禽胚或细胞，分离过程比较复杂并对试验操作要求较高一般基层试验室难以进行。免疫荧光抗体技术特异性强、敏感性高，是衣原体抗原鉴定比较理想的方法，但荧光显微镜价格昂贵不适合作为常规检测方法。聚合酶链反应虽然有较高的特异性和敏感性制备模板比较复杂所需样本量大，且需要PCR仪等贵重仪器，检测试剂昂贵。双抗夹心酶联免疫吸附试验方法具有简便，灵敏，高效等特点但目前国内没有能够检测禽衣原抗原的ELISA试剂盒。补体结合试验操作繁琐、敏感性低、检测时间长、需要较高的专业知识，因此在临床应用中受到较多限制。间接血凝试验方法操作程序简单、不需要特殊设备，但是结果判定受主观因素影响较大，而且耦合抗原多为全菌体，可能与部分革兰氏阴性菌存在交叉反应，结果易产生假阳性。胶体金试纸条法操作简单易行但检测敏感性较低。酶联免疫吸附试验是用于血清抗体检测的常用方法，若能选择并制备适宜的包被抗原及通用性好的酶联二抗用于禽衣原体病ELISA抗体检测，则可达到通用性好、操作简便、所需时间短、降低操作人员主观因素影响的目标，从而弥补上述对鹦鹉热衣原体检测方法的不足。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒，所述试剂盒包括：包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的固相载体，酶标抗体，禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清，禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清；所述鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述固相载体包被鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP后，经抗原保护剂处理，所述抗原保护剂含有2％的β-1，3/1,6葡聚糖，20％的甘油和0.01％的明胶，余量为PBS。作为优选，本专利技术为了提供一种酶联免疫反应试剂盒，所述固相载体为采用酶标板，如96孔酶标板。进一步地，本专利技术提供了包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的酶标板的制备方法为：1)以鹦鹉热衣原体6BC株总DNA为模板，使用特异性引物MOMP-F和MOMP-R进行扩增，得到1143bp的目的片段，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；MOMP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC；MOMP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG；2)将扩增所得片段回收纯化后用EcoRlI和SalI双酶切回收纯化目的片段；3)将酶切好的目的片段与用相同酶切的PET28a(+)载体连接获得重组表达质粒；4)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)内，37℃培养，IPTG诱导表达；5)将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于适量体积的pH7.2的PBS溶液中，经过超声裂解处理后离心取沉淀；6)重复第5)步，获得的沉淀为重组蛋白包涵体；7)将步骤6)的沉淀经尿素溶解、透析复性后，与Ni-NTA琼脂糖凝胶混匀，低温结合；8)将结合完毕后的蛋白与Ni-NTA琼脂糖混合物，倒入空Ni-NTA柱，以20mmol/L咪唑溶液洗涤，除去杂蛋白；9)以250mmol/L的咪唑溶液洗脱Ni-NTA柱，收集经SDS-PAGE分析达到95％以上纯化程度的重组蛋白MOMP洗脱液；10)将收集的蛋白洗脱液体装入透析袋中，在20倍体积的PBS溶液中透析去除咪唑，冷冻抽干获得干粉重组蛋白MOMP；11)将重组蛋白干粉以pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液稀释为终浓度0.5μg/mL，加入酶标板各孔，4℃孵育16小时，用洗涤缓冲液PBST冲洗酶标板，再用封闭液(含5％脱脂奶粉的PBST溶液)封闭，以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干以封闭液200μL/孔封闭，37℃温育2小时，倒掉封闭液，PBST洗涤3次甩干倒掉封闭液，洗涤，甩干；12)封闭好的微孔板每孔加入200微升的抗原保护剂，37℃孵育4小时后，倒掉抗原保护剂，洗涤，甩干，晾干，即获得包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的酶标板。进一步地，为了使检测试剂盒具有更好的通用本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的固相载体，酶标抗体，禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清，禽鹦鹉热衣原体阳性对照血清；所述鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种酶联免疫检测禽鹦鹉热衣原体的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒包括：包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的固相载体，
酶标抗体，禽鹦鹉热衣原体阴性对照血清，禽鹦鹉热衣原体阳性对照
血清；
所述鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的氨基酸序列如SEQID
NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体包
被鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP后，经抗原保护剂处理，所述抗原保
护剂含有2％的β-1，3/1,6葡聚糖，20％的甘油和0.01％的明胶，余量
为PBS。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为
酶标板，包被有鹦鹉热衣原体重组蛋白MOMP的酶标板的制备方法
为：
1)以鹦鹉热衣原体6BC株总DNA为模板，使用特异性引物
MOMP-F和MOMP-R进行扩增；
MOMP-F：AAAGAATTCTTGCCTGTAGGGAACCC；
MOMP-R：GGGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAG；
2)将扩增所得片段回收纯化后用EcoRlI和SalI双酶切回收纯化
目的片段；
3)将酶切好的目的片段与用相同酶切的PET28a(+)载体连接获得
重组表达质粒；
4)将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)内，37℃培养，IPTG
诱导表达；
5)将菌液离心收集沉淀，将沉淀重溶于pH7.2的PBS溶液中，经
过超声裂解处理后离心取沉淀。
6)重复第5)步，获得的沉淀即为重组蛋白包涵体；
7)将步骤6)的沉淀经尿素溶解、透析复性后，与Ni-NTA琼脂
糖凝胶混匀，低温结合；
8)将结合完毕后的蛋白与Ni-NTA琼脂糖混合物，倒入空Ni-NTA
柱，以20mmol/L咪唑溶液洗涤，除去杂蛋白；
9)以250mmol/L的咪唑溶液洗脱Ni-NTA柱，收集经SDS-PAGE
分析达到95％以上纯化程度的重组蛋白MOMP洗脱液；
10)将收集的蛋白洗脱液体装入透析袋中，在20倍体积的PBS溶
液中透析去除咪唑，冷冻抽干获得干粉重组蛋白MOMP；
11)将重组蛋白干粉以pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液稀释为终浓
度0.5μg/mL，加入酶标板各孔，4℃孵育16小时，用洗涤缓冲液PBST
冲洗酶标板，再用封闭液(含5％脱脂奶粉的PBST溶液)封闭，倒掉封
闭液，洗涤，甩干；
12)封闭好的微孔板每孔加入200微升的抗原保护剂，pH7.2溶液
37℃孵育4小时后，倒掉...

【专利技术属性】
技术研发人员：何诚，吴宗学，张强，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11